溫膽湯對失眠小鼠腦組織線粒體結構和功能的影響

李莉 劉茹 何晶 陳云 郭娟 陳紅 劉玲

(湖北中醫藥大學，湖北 武漢 430065)

失眠為最常見的睡眠障礙和第二大精神障礙〔1〕，其主要特征為睡眠質量、睡眠啟動或睡眠維持不佳，并伴有嚴重的痛苦和日間功能障礙〔2〕。據估計，大約有30%的成年人受到睡眠障礙的困擾，其中6%～10%被診斷為失眠〔3〕，其主要見于年齡較大人群〔2〕。一項有關失眠在我國普通人群中的綜合發病率Meta分析顯示，我國失眠綜合患病率為15%，且正在逐步年輕化，平均年齡小于43.7歲的患病率明顯高于43.7歲及以上人群〔4〕。長期失眠會誘發多種疾病，同時，失眠也是抑郁癥、躁郁癥、焦慮癥、糖尿病等多種疾病的常見的并發癥〔5,6〕。目前，西醫治療失眠的主要手段為藥物治療和認知行為療法，但由于藥物往往會引起過度鎮靜、耐受、成癮和神經毒性等不良反應及認知行為療法的資源稀缺、費用昂貴，難以推廣等問題〔3〕，許多失眠患者轉而求助于非處方藥物。中藥是我國最常見的治療失眠的方法之一，溫膽湯最初記載于姚僧垣所著的《集驗方》中，主要用于治療由“痰”而引起的各種病癥〔7〕。中醫認為，失眠病位在心，與五臟六腑密切相關，病機為痰熱內擾〔8〕。既往研究結果顯示，溫膽湯及其加減方可顯著改善失眠患者睡眠質量，并具有作用溫和、副作用小及治療復發率低等優點〔9〕。近來，研究表明睡眠障礙會對線粒體造成影響〔10〕。大腦具有較高的代謝率和能量需求，線粒體作為細胞產能的主要場所，大腦很大程度上依賴于線粒體功能〔11〕，因此，本研究通過構建失眠小鼠模型探究溫膽湯對失眠小鼠腦組織線粒體的作用。

1 材料與方法

1.1主要材料 溫膽湯方劑由湖北省中醫院門診中藥房提供，方劑配方為半夏(6 g，批號：19021091)、竹茹(6 g，批號：18122371)、麩炒枳實(6 g，批號：19031361)、陳皮(9 g，批號：19051171)、炙甘草(3 g，批號：19040261)、茯苓(4.5 g，批號：19061131)。方劑進行二次煎制，第一次，加入藥材8倍量水，煎至沸騰后，持續40 min，過濾取汁；第二次，加入藥材6倍量水，煎至沸騰后持續30 min，過濾取汁，兩次汁液混合后，濃縮成1∶1藥液備用。

實驗用4～5周齡SPF級昆明種雌性小鼠由三峽大學提供，共30只，體重為(20±2)g，合格證No.42010200003462，實驗動物使用許可證號SYXK(鄂)2018-0104。實驗用主要試劑包括艾司唑侖片(華中藥業股份有限公司，襄陽)；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，北京，貨號：R0010、PC0020)；兔抗己糖激酶(HK)1、HK2、葡萄糖轉運蛋白(GLUT)1、β-actin抗體，羊抗兔二抗(武漢貝茵萊生物科技有限公司，武漢，貨號：PAB30519、PAB30271、MAB37348、PAB36265、SAB43714)；線粒體膜電位檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，上海，貨號：C2006)；三磷酸腺苷(ATP)含量測試盒、乳酸測試盒(南京建成生物工程研究所，南京，貨號：A095-1-1、A019-2-1)；鋨酸(Ted Pella Inc，美國，貨號：18456)；醋酸鈾(Merck KGaA，德國，貨號：1005-25g)；戊二醛(國藥集團化學試劑有限公司，上海，貨號：30092436)。實驗用主要儀器包括全自動化學發光分析儀(上海天能科技有限公司，上海，型號：Tanon-5200)；流式細胞儀(ACEA，美國，型號：NovoCyte)；酶標儀(Ladsystems，美國，型號：MK3)；透射電鏡(日立，日本，型號：HT7700)。

1.2方法

1.2.1構建失眠小鼠模型 30只SPF級昆明種雌性小鼠，隨機挑取24只采用改良版水平轉盤睡眠剝奪法構建失眠模型〔12〕。使用亞克力塑料板構建一個長為110 cm、寬為60 cm、高為40 cm的睡眠剝奪箱，以10 cm的縱向距離和13 cm的橫向距離為標準，在其底部固定15個高為8 cm、直徑為6.5 cm的圓柱形平臺，注入23～25℃水至平臺下1 cm處，保持水溫。待小鼠適應性培養7 d后，對待造模小鼠進行站立訓練，將其放置于圓柱平臺上，當小鼠即將入睡時，由于肌肉松弛垂頭觸水或落入水中而驚醒，使其被迫保持清醒站立。造模期間(2 w)，小鼠于早晚各拿出休息1次，每次30 min，每2 d記錄1次小鼠行為學改變(精神狀態、飲食)、毛發和體重變化。

1.2.2分組與處理 24只失眠模型小鼠隨機等分為4組，分別為模型組、溫膽湯低劑量組(10 mg/kg)、溫膽湯高劑量組(45 mg/kg)及艾司唑侖片組(0.15 mg/kg)，剩余6只未造模小鼠設置為正常對照組。站立訓練第2周(第8天)開始進行灌胃給藥處理，每次給予0.5 ml藥液灌胃，正常對照組及模型組小鼠給予0.5 ml蒸餾水灌胃。末次灌胃給藥12 h后，戊巴比妥鈉過量麻醉處死小鼠(100 mg/kg)，收集腦組織，于-80℃保存。

1.2.3透射電鏡觀察海馬組織和下丘腦線粒體形態 取各組小鼠海馬組織及下丘腦，于4℃下，使用2.5%戊二醛預固定30 min以上，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，每次10 min。使用1%鋨酸后固定1 h后，經梯度乙醇和梯度丙酮處理脫水，丙酮與環氧樹脂進行半浸透，純環氧樹脂進行全浸透。對固定、脫水、浸透后的樣本進行包埋處理和切片處理，得到60 nm超薄切片，使用醋酸鈾避光染色20 min，雙蒸水水洗3次，吸干，枸櫞酸鉛避光染色15 min后，透射電鏡觀察線粒體形態。

1.2.4流式細胞儀檢測腦組織細胞線粒體膜電位 收集各組小鼠腦組織細胞懸液，取1×106個細胞，重懸于0.5 ml細胞培養液中，并加入0.5 ml JC-1染色工作液，混合均勻，置于37℃、5%CO2細胞培養箱中孵育20 min。400 r/min離心3 min，收集沉淀，JC-1染色緩沖液洗滌2次，加入1 ml JC-1染色工作液重懸細胞，400 r/min離心3 min，重復以上步驟2次，加入400 μl JC-1染色緩沖液重懸細胞，上機檢測，并使用NovoCyte分析軟件對其進行分析。

1.2.5生化檢測腦組織中ATP乳酸濃度 取各組小鼠腦組織樣本，根據ATP及乳酸檢測試劑盒說明書進行操作，測定其濃度。

1.2.6Western印跡檢測腦組織HK1、HK2和GLUT1表達水平 取各組小鼠腦組織樣本，將其剪成細小碎片，按10 μl/mg的量加入裂解液，裂解至完全裂解，于4℃下，12 000 r/min離心15 min，測定上清液蛋白濃度，根據其結果上樣至SDS-PAGE凝膠，電泳分離蛋白后轉膜至PVDF膜。使用5%脫脂牛奶于4℃低溫環境中封閉過夜，加入1∶1 000稀釋的HK1、HK2、GLUT1、β-actin抗體，室溫孵育1 h，PBST洗滌5 min，重復洗滌3次，加入1∶20 000稀釋二抗，室溫孵育1 h，PBST洗滌5 min，重復洗滌3次。于暗室中加入ECL發光液進行反應后，在全自動化學發光分析儀中檢測結果并讀取灰度值，以β-actin為內參分析其灰度值。

1.3統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1溫膽湯方劑對失眠小鼠體重的影響 與正常對照組〔(34.02±2.55)g〕比較，失眠模型組精神狀態及毛發較差，飲食量減少，體重〔(19.60±0.72)g〕顯著減輕(P<0.05)。與模型組比較，溫膽湯低劑量組〔(23.52±0.84)g〕、高劑量組〔(26.13±1.73)g〕及艾司唑侖片組體重〔(28.75±1.67)g〕顯著增加(P<0.05)，小鼠的精神狀態、毛發及飲食情況均得到改善。

2.2溫膽湯方劑對失眠小鼠腦組織線粒體結構的影響 正常對照組海馬組織和下丘腦中線粒體數量較多，其形態正常，線粒體嵴清晰。失眠模型組海馬組織和下丘腦中線粒體數量減少，線粒體出現明顯腫脹、破損，大部分嵴斷裂、溶解，出現空白區域，形成空泡樣。與模型組比較，溫膽湯方劑組及艾司唑侖片組腦組織中線粒體損傷有所改善，且溫膽湯方劑高劑量組的改善效果優于溫膽湯方劑低劑量組。見圖1。

圖1 各組海馬組織及下丘腦線粒體結構比較(×8 000)

2.3溫膽湯方劑對失眠小鼠腦組織線粒體膜電位的影響 流式檢測各組腦組織細胞線粒體膜電位結果顯示，較正常對照組〔(8.81±0.60)%〕，模型組線粒體膜電位下降細胞所占比例〔(46.58±0.77)%〕顯著增加(P<0.05)。給藥干預后，與模型組相比，溫膽湯低劑量〔(34.23±1.35)%〕、溫膽湯高劑量組〔(23.56±0.65)%〕及艾司唑侖片組中線粒體膜電位下降細胞所占比例〔(20.79±0.33)%〕均顯著減少(P<0.05)，且溫膽湯方劑高劑量組減少效果顯著優于溫膽湯方劑低劑量組(P<0.05)。見圖2。

圖2 流式細胞儀檢測各組腦組織細胞線粒體膜電位變化

2.4溫膽湯方劑對失眠小鼠腦組織線粒體功能的影響 與正常對照組比較，模型組腦組織中ATP濃度降低，乳酸濃度增加，差異有統計學意義(P<0.05)。經溫膽湯方劑和艾司唑侖片干預治療后，ATP及乳酸濃度降低，差異有統計學意義(P<0.05)，且溫膽湯高劑量組的影響效果高于低劑量組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.5溫膽湯方劑對失眠小鼠腦組HK1、HK2和GLUT1表達的影響 與正常對照組比較，模型組腦組織中HK1、HK2和GLUT1表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，溫膽湯低、高劑量組及艾司唑侖片組腦組織中HK1、HK2和GLUT1表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)，且溫膽湯濃度越高，表達下降越多(P<0.05)。見表1、圖3。

表1 各組腦組織ATP、乳酸水平及HK1、HK2和GLUT1蛋白表達水平比較

1～5：正常對照組，模型組，溫膽湯低劑量組，溫膽湯高劑量組，艾司唑侖片組圖3 Western印跡檢測腦組織HK1、HK2和GLUT1蛋白表達水平

3 討 論

失眠可影響各年齡階層人群，但其多發與于婦女及老年人群〔2〕。近年來，隨著快速的城市化和工業化，年輕人經常面臨職業壓力，夜間長時間工作，及其對電腦、智能手機等新媒體的廣泛使用等問題，打亂了其生物睡眠節奏，誘發導致年輕人群中失眠發病率增加〔4〕。中醫認為失眠病因多為虛實兩證，即肝郁、痰熱、心火等相關實證和心脾氣血虛弱有關虛證。溫膽湯溫涼兼顧，以半夏為君藥，竹茹為臣藥，君臣相伍，合并燥濕化痰及清熱化痰之效，同時輔以陳皮和枳殼理氣化痰，茯苓健脾滲濕、絕生痰之源，以達治療失眠之效〔8〕。本研究結果進一步證明了溫膽湯具有緩解失眠癥狀的療效。

在現代醫學中，下丘腦作為覺醒、睡眠中樞與具有睡眠調節作用、促進慢波睡眠的海馬組織是失眠研究的重要觀察點〔13,14〕。線粒體作為以ATP的形式提供細胞95%能量的細胞器對神經元的興奮性、生存以及各腦組織功能的維持至關重要〔15〕。研究表明，失眠將導致大腦組織線粒體結構損壞和功能障礙〔15〕。短暫的睡眠時間會增加線粒體活性氧(ROS)的產生、脂質的過氧化作用及氧化應激反應相關的基因的表達〔10〕，同時線粒體作為細胞氧化應激損傷的靶器官，可導致線粒體發生氧化應激損傷〔16〕。田苗等〔17〕及徐磊等〔18〕分別證明了不同加味溫膽湯可減輕肝臟線粒體氧化應激反應或減輕腸組織線粒體結構損傷。本研究結果提示，溫膽湯方劑可緩解失眠小鼠腦組織線粒體結構損傷和功能障礙。

既往研究表明，細胞線粒體功能障礙可表現為糖酵解優于氧化磷酸化，糖酵解途徑生成乳酸，其途徑ATP生成小于氧化磷酸化途徑，從而導致細胞呼吸過程中乳酸生成增多，ATP生成減少〔19～21〕。Wisor等〔22〕研究發現，在強迫清醒的過程中腦組織乳酸生成增加。本研究結果提示，失眠小鼠腦細胞糖酵解增強，進一步解釋了失眠小鼠腦組織ATP濃度降低的可能機制為糖酵解優于氧化磷酸化。GLUT1是促進性GLUT轉運蛋白家族(SLC2)成員，是哺乳動物細胞中最保守、分布最廣的葡萄糖轉運蛋白〔23〕。Cho等〔23〕研究顯示，GLUT1上調可有助于糖酵解速率和乳酸生成的增加。HK為糖酵解途徑的關鍵限速酶之一，降低其活性可降低細胞糖酵解水平〔24〕。因此，GLUT1及HK可用于衡量糖酵解水平。本研究結果顯示，進一步提示溫膽湯可緩解失眠小鼠腦組織線粒體功能障礙。