LncRNA LINC00941/miR-597-5p/ARHGEF4分子軸促進神經膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲的機制

王媛 洪軍 王樹偉 王海波 趙迪 張浩良

(1唐山市工人醫院神經外科，河北 唐山 063000；2河北醫科大學附屬第一醫院神經外科；3唐山市工人醫院腫瘤科)

神經膠質瘤是全球常見的顱內惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類生命健康，其發病率占原發性顱內腫瘤的30%～40%；由于其在顱內呈浸潤性生長，導致其癌灶的組織邊界并不清晰，其總體預后仍不理想〔1〕。因此，深入研究神經膠質瘤的發病機制，尋找神經膠質瘤有效治療的新策略是全球亟待解決的關鍵科學問題。研究表明LncRNA參與調控腫瘤的發生發展過程，且在調控癌相關基因中發揮重要作用〔2〕。以 LncRNA為切入點探索其在神經膠質瘤的發生發展中所扮演的角色，這對于揭示神經膠質瘤的發病機制、尋找腫瘤標志物和藥物靶點、判斷疾病預后、構建疾病風險評估模型等具有重要意義。研究報道LINC00941定位于12號染色體短臂，LINC00941的表達與胃癌腫瘤的深度和遠處轉移有關；LINC00941沉默在體外可抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并在體內調節腫瘤的生長〔3〕。LINC00941可能是治療或診斷胃癌的潛在新生物標志物〔4〕。LINC00941還與頭頸部鱗狀細胞癌的生存時間有關，是具有診斷和預后價值的LncRNA〔5〕。然而LINC00941對膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響及機制尚不清楚。結腸癌組織和LoVo細胞中miR-597-5p表達均顯著下調，上調其表達可抑制結腸癌細胞的遷移和侵襲〔6〕。circ-101555可能充當海綿體競爭結合miR-597-5p而促進結直腸癌的進展〔7〕。Rho型鳥嘌呤核苷酸交換因子(RhoGEF)是調節Rho GTPase活性的關鍵因子，與腫瘤、發育及神經類疾病等有密切關系〔8〕。研究報道Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子(ARHGEF)4高表達與腺癌整體生存期較差的獨立預測因子相關，并促進胰腺癌細胞侵襲〔9〕。本研究旨在分析LINC00941對膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響及機制。

1 材料與方法

1.1主要材料 正常的人類神經膠質細胞HEB，膠質瘤細胞系LN18、SW1088、Hs683購自美國模式菌種收集中心(ATCC)；胎牛血清、RPMI1640培養基購自美國Gibco公司；Trizol試劑、逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自日本；RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸(BCA)試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)試劑盒購自上海拜力生物科技有限公司；Transwell小室、Matrigel購自美國BD公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2細胞處理與分組 正常的人類神經膠質細胞HEB和膠質瘤細胞系LN18、SW1088、Hs683用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液在37℃、5% CO2條件下培養；取對數生長期細胞LN18，將si-NC、si-LINC00941、pcDNA-NC、pcDNA-LINC00941、miR-NC、miR-597-5p、anti-miR-NC、anti-miR-597-5p、si-ARHGEF4轉染至細胞LN18中，分別記為si-NC組、si-LINC00941組、pcDNA-NC組、pcDNA-LINC00941組、miR-NC組、miR-597-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-597-5p組、si-ARHGEF4組；將si-LINC00941分別與anti-miR-NC、anti-miR-597-5p、pcDNA-NC、pcDNA-ARHGEF4共轉染至細胞LN18中，記為si-LINC00941+anti-miR-NC組、si-LINC00941+anti-miR-597-5p組、si-LINC00941+pcDNA-NC組、si-LINC00 941+pcDNA-ARHGEF4組。

1.3實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測LINC00941、miR-597-5p和ARHGEF4 mRNA的表達 提取各組細胞總RNA，反轉錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒說明進行PCR，PCR體系：2 μl反轉錄產物、10 μl SYBR Green Mix、上下游引物各0.5 μl，7 μl無菌水；反應條件為95℃ 4 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個循環。相對表達量用2-△△Ct法計算。以GAPDH和U6為內參，LINC00941上游：5′-AGGAGGGCAGGTCAGGTTAT-3′，下游：5′-TTGGGCAACCTAATGAGACC-3′；miR-597-5p上游：5′-TACTTACTCTACGTGTGTG-3′，下游：5′-GACCAGTACTCTACATTACGC-3′；ARHGEF4上游：5′-CCCA GTTGCTCTCACAGTCA-3′，下游：5′-TGTGTCTTCTCCAGCCACAG-3′；GAPDH上游：5′-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3′，下游：5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′；U6上游：5′-CGCTTCGGCAGCACATA TACTA-3′，下游：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3′；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.4Western印跡法檢測ARHGEF4、細胞周期蛋白(Cyclin)D1、基質金屬蛋白酶(MMP)2和MMP9蛋白表達 提取各組細胞總蛋白，BCA試劑盒進行定量。將蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)4℃孵育過夜，洗膜后加入二抗(1∶2 000)室溫孵育90 min，用ECL發光液顯影，成像后用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的條帶灰度值和內參β-actin條帶灰度值的比值作為蛋白相對表達水平。

1.5MTT檢測細胞活性 各組細胞培養48 h后加入20 μl MTT溶液，繼續培養4 h，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min使沉淀溶解，用酶標儀檢測波長450 nm處吸光度(OD)，以OD表示細胞活性。

1.6Transwell檢測細胞遷移和侵襲 細胞侵襲實驗：Transwell上室加入100 μl稀釋好的基質膠，使其鋪滿小室，然后在37℃培養箱使其凝固。然后加入100 μl細胞懸液，下室加入500 μl含血清培養液，37℃培養24 h后用0.1%結晶紫染色，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2遍，棉簽擦拭掉上層未穿過基底膜的細胞，光學顯微鏡(×200)下隨機選擇視野拍照計數。細胞遷移實驗：除不用基質膠包被Transwell上室，其余與細胞侵襲實驗操作相同。

1.7雙熒光素酶報告實驗檢測LINC00941和miR-597-5p及miR-597-5p和ARHGEF4的靶向關系 構建含有miR-597-5p結合位點的LINC00941和ARHGEF4野生型和突變型熒光素酶報告載體，將其分別與miR-NC和miR-597-5p共轉染至LN18細胞中。按照說明書檢測熒光素酶活性。

1.8統計學分析 采用SPSS20.0軟件行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1在膠質瘤細胞系中LncRNA LINC00941、miR-597-5p、ARHGEF4表達情況 與正常的人類神經膠質細胞HEB相比，膠質瘤細胞系LN18、SW1088、Hs683中LncRNA LINC00941表達水平升高，miR-597-5p表達水平降低，ARHGEF4 mRNA和蛋白表達水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1，圖1。

表1 膠質瘤細胞系中LncRNA LINC00941、ARHGEF4和miR-597-5p 表達量

2.2低表達LncRNA LINC00941 對膠質瘤細胞LN18增殖、遷移和侵襲的影響 與si-NC組比較，si-LINC00941組LINC00941、CyclinD1、MMP2和MMP9表達水平細胞活性、細胞遷移和侵襲數量均顯著降低(P<0.05)，見表2,圖2，圖3。

圖1 Western印跡檢測ARHGEF4蛋白表達

表2 低表達LncRNA LINC00941 對膠質瘤細胞LN18增殖、遷移和侵襲的影響

圖2 Transwell檢測細胞的遷移和侵襲(結晶紫染色，×400)

2.3高表達miR-597-5p對膠質瘤細胞LN18增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-NC組比較，miR-597-5p組miR-597-5p表達水平升高，CyclinD1、MMP2和MMP9表達水平降低，細胞活性降低，細胞遷移和侵襲數量降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖4，表3。

2.4低表達ARHGEF4對膠質瘤細胞LN18增殖、遷移和侵襲的影響 與si-NC組比較，si-ARHGEF4組ARHGEF4、CyclinD1、MMP2和MMP9表達水平降低，細胞活性降低，細胞遷移和侵襲數量降低(P<0.05)，見表4，圖5。

圖3 Western印跡檢測兩組CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達

圖4 Western印跡檢測兩組CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達

2.5LncRNA LINC00941靶向miR-597-5p，miR-597-5p靶向ARHGEF4 LncBase Predicted v.2在線軟件預測顯示，miR-597-5p 和LncRNA LINC00941存在互補的結合位點(圖6A)；TargetScan在線軟件預測顯示，ARHGEF4和miR-597-5p 存在互補的結合位點(圖6B)。

表3 高表達miR-597-5p對膠質瘤細胞LN18增殖、遷移和侵襲的影響

表4 低表達ARHGEF4對膠質瘤細胞LN18增殖、遷移和侵襲的影響

圖5 Western印跡檢測兩組ARHGEF4、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達

雙熒光素酶報告實驗結果顯示，miR-NC或miR-597-5p與LINC00941、ARHGEF4野生型及突變型報告質粒共轉染LN18細胞后，與miR-NC組(1.00±0.10、1.00±0.08)相比，miR-597-5p組轉染LINC00941、ARHGEF4野生型的細胞熒光素酶活性(0.42±0.04、0.46±0.04)顯著降低(均t=16.155、18.112，均P=0.000)；而轉染突變型的細胞熒光素酶活性(1.01±0.11 vs 0.98±0.09;1.02±0.10 vs 0.98±0.08)無顯著變化(t=0.633、0.937，P=0.536、0.363)。與pcDNA-NC組(1.00±0.10)相比，pcDNA-LINC00941組miR-597-5p表達水平(0.43±0.04)顯著降低，與si-NC組(1.01±0.09)相比，si-LINC00941組miR-597-5p表達水平(1.32±0.11)顯著升高(P<0.05)。與miR-NC組(0.84±0.08)相比，miR-597-5p組ARHGEF4蛋白表達水平(0.43±0.04)顯著降低，與anti-miR-NC組(0.85±0.07)相比，anti-miR-597-5p組ARHGEF4蛋白表達水平(1.12±0.11)顯著升高(P<0.05)。

2.6下調miR-597-5p能夠逆轉LINC00941低表達對LN18細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與si-LINC00941+anti-miR-NC組比較，si-LINC00941+anti-miR-597-5p組miR-597-5p表達水平降低，CyclinD1、MMP2和MMP9表達水平升高，細胞活性升高，遷移、侵襲細胞數升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖7，表5。

A：LncBase Predicted v.2對miR-597-5p 和LncRNA LINC00941結合進行預測示意圖，B：TargetScan對ARHGEF4和miR-597-5p 結合進行預測示意圖，C：Western印跡檢測ARHGEF4蛋白表達圖6 LncRNA LINC00941靶向miR-597-5p，miR-597-5p 靶向ARHGEF4

1～2，si-LINC00941+anti-miR-NC組,si-LINC00941+anti-miR-597-5p組圖7 Western印跡檢測CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達

2.7上調ARHGEF4能夠逆轉LINC00941低表達對LN18細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與si-LINC00941+pcDNA-NC組比較，si-LINC00941+pcDNA-ARHGEF4組ARHGEF4、CyclinD1、MMP2和MMP9表達水平、細胞活性、遷移、侵襲細胞數均顯著升高(P<0.05)，見表6，圖8。

表5 下調miR-597-5p 能夠逆轉LINC00941低表達對LN18細胞增殖、遷移和侵襲的影響

表6 上調ARHGEF4能夠逆轉LINC00941低表達對LN18細胞增殖、遷移和侵襲的影響

1～2:si-LINC00941+pcDNA-NC組、si-LINC00941+pcDNA-ARHGEF4組圖8 上調ARHGEF4能夠逆轉LINC00941低表達對LN18細胞增殖、遷移和侵襲的影響

3 討 論

神經膠質瘤發病率高、侵襲性強、預后差，中位無進展生存期及中位總生存期較短；隨著科研的發展，一些新興靶向抗腫瘤藥物應運而生，給神經膠質瘤的醫治帶來了新希望〔10〕。研究表明LncRNA與腫瘤的進展密切相關，如肺腺癌患者存活率降低與LINC00941高表達有關〔11〕。結直腸癌組織中LINC00941 RNA的表達水平顯著高于癌旁組織，干擾LINC00941表達可降低結直腸癌HCT116細胞增殖速度〔12〕。本實驗結果表明LINC00941或可能與膠質瘤有關。本實驗進一步轉染LINC00941干擾表達載體，表明LINC00941低表達可抑制膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲。

有研究報道miR-597-5p在HPV16陽性子宮頸癌中差異表達〔13〕。miR-597-5p與胃癌的轉移和侵襲相關〔14〕。本實驗結果顯示，miR-597-5p在膠質瘤細胞系中低表達，高表達可抑制膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲。下調miR-597-5p能逆轉LINC00941低表達對LN18細胞增殖、遷移和侵襲的影響。本實驗通過Targetscan預測顯示miR-597-5p與ARHGEF4具有結合位點，且雙熒光素酶實驗證實miR-597-5p可靶向調控ARHGEF4。研究報道靶向ARHGEF4的小干擾RNA有效傳遞到胰腺癌細胞中可抑制胰腺腫瘤的侵襲和轉移〔15〕。本實驗結果顯示，膠質瘤細胞系中ARHGEF4高表達，低表達ARHGEF4可抑制膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲。且本實驗還發現上調ARHGEF4均能逆轉LINC00941低表達對LN18細胞增殖、遷移和侵襲的影響。

綜上，LncRNA LINC00941下調表達可能通過miR-597-5p/ARHGEF4分子軸抑制神經膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲。為以LncRNA LINC00941及其互作分子作為膠質母細胞瘤診斷標準和治療靶點及膠質母細胞瘤靶向藥物的研發提供新思路。