雷公藤紅素改善阿爾茨海默病大鼠學習能力的作用機制

邵亞 李紅

(1甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050；2深圳市羅湖區中醫院)

阿爾茨海默病(AD)是一種神經系統退行性疾病〔1〕，其病理改變當下流行的觀點認為是β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積導致老年斑形成、神經纖維纏結及廣泛神經元缺失〔2〕。自噬是一種重要的蛋白質降解途徑，病態的自噬功能將會促進細胞內Aβ的生成。自噬缺陷發生在AD的早期，自噬啟動，特征蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ將顯著性地增長〔3,4〕。本實驗觀察雷公藤紅素(Qu)干預下的AD大鼠模型學習記憶能力的提高及特征性自噬蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ的變化、神經系統變性疾病中有毒蛋白Aβ、p-Tau的表達變化，來探索Qu治療AD可能的機制是通過調節細胞的自噬途徑來實現。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組 購自甘肅中醫藥大學科研實驗中心120只SPF級Wistar大鼠，體重為(250±10)g。從中分出20只為對照組，雙側海馬給予同等劑量的生理鹽水代替造模藥物。剩下100只，采用Aβ1～42至大鼠雙側海馬構建AD模型，造模后隨機分為5組(AD模型組、Qu高、中、低劑量組、雷帕霉素組)，實驗室飼養，規律晝夜光照。

1.2試劑與藥物 Qu(南京澤朗醫藥科技有限公司，批號：209B021)；雷帕霉素(索萊寶公司，批號：412H031)；Aβ1～40抗體(Bioss，批號：AG10091626)；Beclin 1抗體(Abcam公司，批號：GR 3198372-7)；Phospho-Tau(Bioss，批號：AE121775)；Beta-Amyloid(ANASPEC PEPTIDE，批號：1855817)；兔SP試劑盒(中杉金橋，批號：SP9001)。

1.3造模與給藥 濃度10%的水合氯醛(4 ml/kg)麻醉大鼠，用鼠腦立體定位儀，體位保持門齒鉤平面低于耳間線平面約2.4 mm，前后鹵處相同平面。將大鼠的頭頂部位去毛備皮并消毒，從頭顱中線開顱，對照Paxinosand Waston，腦立體定位儀確定前囟后3.3 mm，中線雙側旁開2.0 mm的位置為雙側海馬CA1區，用牙科鉆鉆開骨窗，膜下2.8 mm，以0.5 μl/min的速度緩慢注入Aβ1～42溶液5 μl，保持5 min，充分彌散，撤針，縫合，在縫合處滴注0.2 ml慶大霉素防止大鼠被感染。將對照組大鼠進行同樣的手術操作，使用同體積的生理鹽水代替造模所用Aβ1～42溶液。在造模后的次日直至第25天，配制Qu 0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、2.0 mg/ml濃度試劑，按1.0 mg/(kg·d)劑量分別腹腔注射于Qu低、中、高劑量組，每日9～10點給藥。同時雷帕霉素組配制溶液為1.0 mg/ml試劑，按1.0 mg/(kg·d)劑量，每日同時間腹腔注射，而對照組則給予等劑量的生理鹽水每日腹腔注射。

1.4取材及組織處理 每組選擇一半大鼠，分離雙側海馬用于蘇木素-伊紅(HE)染色分析和海馬Aβ、p-Tau表達免疫組化測定；剩余的一半，分離雙側海馬用于Beclin-1、LC3-Ⅱ表達Western印跡檢測。 10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉，0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)200 ml灌注沖洗血管床約20 min，直至流出液體清亮，4%多聚甲酸灌注30 min，切取包含海馬的腦組織。4%多聚甲醛固定48 h，常規石蠟包埋，切4 μm的切片，附于防脫載玻片，6℃烤箱過夜干燥用于免疫組化(SABC)方法分析海馬各亞區中Aβ1～40、p-Tau的表達量。冰上分離海馬，液氮保存，隨后轉至-80℃冰箱保存，用于Western印跡檢測。

1.5指標與檢測方法 利用Morris水迷宮測試各組大鼠學習記憶能力。制作腦組織海馬HE染色切片，用Olympus顯微圖像分析系統觀察和分析大鼠海馬結構、神經元形態和免疫組化陽性細胞。HE染色后的細胞不同結構的顏色和形態分別為：細胞核核仁呈現藍色，細胞質呈淡紅色，調亡細胞形態為細胞核腫脹、核仁顏色變淡，細胞核模糊，細胞排列松散。免疫組化法觀察大鼠海馬結構內各亞區神經元Aβ1～40和p-Tau蛋白的陽性表達情況，陽性結果：在胞質區域呈現棕黃色；細胞核呈藍色。計算表達率：圖像采集后使用 Image-Pro Plus6.0 圖像分析軟件計算出圖像中陽性染色的平均光密度值。Western印跡法測定海馬中蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ表達量。

1.6統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行方差分析，組間兩兩比較釆用LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1Morris水迷宮檢測各組學習記憶能力改善的比較 實驗各組大鼠隨著時間的延長，逃避潛伏期均呈現逐漸減少趨勢。組間兩兩比較，與AD模型組相比，第1天訓練成績只有對照組有差異(P<0.05)，余各組均無明顯差異；第2、3、4，5天訓練成績只有Qu低劑量組無明顯差異，余各組均有明顯差異(P<0.05)。Qu各組隨藥物劑量增加，學習記憶能力改善明顯，且雷帕霉素組優于雷公藤紅素各組(P<0.05)。空間探索試驗 Morris水迷宮訓練4天后，第5天開始撤出平臺開展對大鼠空間探索能力的測試，結果顯示：與對照組相比，AD模型組有效區域滯留時間和有效區域滯留時間百分比、逃避平臺滯留時間顯著縮短(P<0.05)；與AD模型組相比，Qu高、中、低劑量組、雷帕霉素組有效區域滯留時間和有效區域滯留時間百分比、逃避平臺滯留時間明顯延長(P<0.05)。Qu高、中、低劑量組有效區域滯留時間和有效區域滯留時間百分比隨著劑量減少而減少，雷公藤紅素高、中、低劑量組有效區域滯留時間和有效滯留時間百分比的平均值、逃避平臺滯留時間均低于雷帕霉素組。見表1。

2.2形態學觀察及HE染色 對照組大鼠海馬CA區細胞大鼠形態如U形，與此相對可見V形齒狀回，所見組織結構清晰，見圖1。AD模型組可見CA 區神經元顯著丟失，錐形細胞呈松散排列，部分細胞核仁不清，細胞核腫脹模糊，正常體積的錐形細胞明顯減少；對照組神經元細胞飽滿、錐形細胞呈緊密排列，核仁染色清楚，細胞核輪廓清晰，體積正常，均勻一致。Qu高劑量組、雷帕霉素組與AD模型組比較海馬組織病理學顯著改善，Qu低劑量組、Qu中劑量組與AD模型組比較海馬組織病理學改善不顯著，見圖2。

表1 各組5 d逃避潛伏期、有效區域的滯留時間、百分比比較

2.3海馬中蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ表達 AD模型組Beclin-1、LC3-Ⅱ表達量顯著低于對照組，Qu高、中、低劑量組、雷帕霉素組顯著高于AD模型組(均P<0.05)，其中Qu的各劑量組隨著藥物劑量的增加，海馬中Beclin-1、LC3-Ⅱ表達量逐漸增加。雷帕霉素組優于Qu各組。見表2、圖3。

2.4免疫組化測定海馬Aβ1～40、p-Tau表達 AD模型組海馬Aβ1～40、p-Tau表達量顯著高于對照組，Qu高、中、低劑量組、雷帕霉素組海馬Aβ1～40表達量顯著低于AD模型組(均P<0.05)。其中Qu的各劑量組隨著藥物劑量的增加，海馬Aβ1～40、p-Tau的表達量逐漸減少。雷帕霉素組優于雷公藤紅素各組。見表2。

圖1 對照組海馬CA區組織結構(HE染色，×40)

圖2 各組海馬CA3區神經元形態(HE染色，×200)

表2 海馬中蛋白Beclin-1、LC3-II、Aβ1-40、p-Tau表達值)

1～6:AD模型組、對照組、Qu低劑量組、Qu中劑量組、Qu高劑量組、雷帕霉素組圖3 各組大鼠海馬內自噬相關蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達

3 討 論

AD主要病理學改變為大腦尤其是海馬區組織的萎縮、Aβ沉積形成的老年斑(SP)、Tau 蛋白過度磷酸化形成的神經元纖維纏結(NFT)及選擇性神經元丟失等〔4，5〕。關于AD的發病機制目前尚不完全清楚，只是存在多種假說，包括Aβ毒性學說、Tau 蛋白異常修飾學說、氧化應激學說、基因突變學說、脂代謝紊亂學說、炎癥學說和膽堿能損傷學說等〔6，7〕。盡管國內外學者對AD的研究深入持續多年，但目前尚未對AD的罹患原因在機制方面有明確的結論〔8～10〕。中醫是我國的傳統醫學，有著自己獨特的診療體系及思維，隨著對中醫藥治療AD的研究深入，單味藥物，復方制劑在臨床中的運用比比可見，而且大量學者對單味中藥及復合中藥方劑的藥理作用做了大量的動物實驗，力圖從中發現中藥及中藥方劑的有效成分及治療AD的作用機制。本研究進一步表明AD可能與自噬機制相關，Qu可能是通過調節自噬機制來改善AD的記憶學習障礙，但AD的發生機制尚不完全明確，多環節，多層系性，極其復雜，所以Qu干預AD大鼠模型的機制尚不完全明確，仍需廣泛和深入的研究。