益氣活血組分黃芪甲苷配伍川芎嗪對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)血管單元的保護(hù)作用

陳紅陽(yáng) 賈壯壯 趙磊 趙晨陽(yáng) 郭利平

(1天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 300120；天津中醫(yī)藥大學(xué)；2第一附屬醫(yī)院；3組分中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

缺血性腦卒中是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)病和多發(fā)病，具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的特點(diǎn)〔1〕，其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中主要涉及興奮性氨基酸毒性、氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等一系列復(fù)雜的生理及病理機(jī)制〔2〕。目前，重組組織型纖溶酶原激活劑(rtPA)被認(rèn)為是最有效的治療方法。血腦屏障(BBB)結(jié)構(gòu)及功能的完整性是治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵部分，其中內(nèi)皮細(xì)胞形成緊密連接(TJs)，保護(hù)BBB結(jié)構(gòu)與功能穩(wěn)定，可有效減少腦損傷后的神經(jīng)元損傷〔3〕。越來(lái)越多的研究從僅關(guān)注包括內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)的BBB及神經(jīng)元，逐漸轉(zhuǎn)化為關(guān)注包括神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的神經(jīng)血管單元(NVU)，強(qiáng)調(diào)多細(xì)胞、多機(jī)制在腦卒中發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用〔4〕。

缺血性腦卒中屬于中醫(yī)的“中風(fēng)”范疇，其病理性質(zhì)多為本虛標(biāo)實(shí)，氣虛血瘀為本病重要的病理機(jī)制之一。前期研究發(fā)現(xiàn)，益氣活血法為名老中醫(yī)治療缺血性腦卒中的主要治法，黃芪-川芎藥對(duì)為重要藥物組合〔5〕。黃芪可補(bǔ)氣健脾、益衛(wèi)固表，川芎可活血行氣、散瘀止痛。黃芪甲苷與川芎嗪分別作為黃芪和川芎的主要活性成分，均可有效減輕腦缺血再灌注損傷，發(fā)揮良好的神經(jīng)保護(hù)作用〔6，7〕。本研究采用黃芪甲苷與川芎嗪組分配伍，探討二者對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠NVU的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar大鼠60只，體質(zhì)量250～270 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006，飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2藥物及試劑 黃芪甲苷(上海士峰生物科技有限公司，批號(hào)：20072518)；川芎嗪(成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-200514103)；依達(dá)拉奉注射液(南京先聲東元制藥有限公司，批號(hào)：80-170510)；免疫染色通透液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)P0096)；冰凍切片抗原修復(fù)液(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)C1035)；離子鈣結(jié)合銜接分子(Iba)1抗體，血小板衍生生長(zhǎng)因子受體(PDGFR)β抗體(英國(guó)Abcam公司，批號(hào)分別為ab178846，ab32570)；神經(jīng)元特異核蛋白(NeuN)抗體，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)抗體(美國(guó)CST公司，批號(hào)24307，3670)；番茄凝集素(LEL，美國(guó)Vectorlab公司，批號(hào)B-1175)。

1.3主要儀器 IX73型倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；DM750M Leica顯微鏡(德國(guó)LEICA公司)；CM-1950冰凍切片機(jī)(德國(guó)LEICA公司)。

1.4模型制備 參考Long〔8〕改良線(xiàn)栓法，制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞/再灌注(MCAO/R)模型，方法如下：予以3%異氟烷氣體麻醉大鼠，并將其固定，采用多普勒腦血流儀監(jiān)測(cè)大鼠局部腦血流變化；將大鼠頸部沿正中線(xiàn)切開(kāi)，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)及頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，于ECA近心端剪V形切口，然后將線(xiàn)栓從V形口緩慢插入大腦中動(dòng)脈，觀察大鼠腦血流變化。大腦中動(dòng)脈栓塞1.5 h后再灌注。假手術(shù)組不做插線(xiàn)栓處理，其余操作同前。

1.5分組與給藥 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、依達(dá)拉奉組(6 mg/kg)、黃芪甲苷組(40 mg/kg)、川芎嗪組(20 mg/kg)、黃芪甲苷配伍川芎嗪(配伍用藥)組(40 mg/kg+20 mg/kg)，每組10只。造模后各組分別進(jìn)行腹腔注射給藥，每日1次，連續(xù)給藥7 d，假手術(shù)組和模型組分別注射等容積生理鹽水。

1.6神經(jīng)功能評(píng)分 參照改良神經(jīng)功能(mNSS)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)〔9〕，進(jìn)行大鼠神經(jīng)功能評(píng)分。評(píng)價(jià)包括運(yùn)動(dòng)測(cè)試、感覺(jué)測(cè)試、平衡測(cè)試、反射測(cè)試、異常運(yùn)動(dòng)。五項(xiàng)測(cè)試評(píng)分之和為神經(jīng)功能總得分，總得分越高，大鼠神經(jīng)功能缺損程度越嚴(yán)重。

1.7蘇木素-伊紅(HE)染色 大鼠腦缺血再灌注7 d后，斷頭取腦，腦組織使用4%多聚甲醛溶液固定48 h后，做厚度5 μm的連續(xù)冠狀石蠟切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色〔10〕。將石蠟切片經(jīng)脫蠟水化處理后，浸于蘇木素染液5 min，鹽酸乙醇分化30 s，伊紅染液浸染15 s，通過(guò)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片后，于高倍鏡下觀察HE染色情況。

1.8尼氏(Nissl)染色 將石蠟切片經(jīng)脫蠟水化處理后，浸于Nissl染液中，56℃恒溫浸染1 h，使用Nissl染色分化液分化30 s，通過(guò)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片后，于高倍鏡下觀察Nissl染色情況。

1.9免疫熒光染色法檢測(cè)NUV 大鼠腦缺血再灌注7 d后，斷頭取腦，將大鼠新鮮腦組織經(jīng)最優(yōu)切削溫度(OCT)包埋后，于-20℃做厚度為20 μm的連續(xù)冠狀冰凍切片。冰凍切片經(jīng)通透、抗原修復(fù)、封閉后，在切片上滴加一抗，即LEL(1∶200)、Iba1(1∶400)抗體、PDGFRβ(1∶200)抗體、NeuN(1∶200)抗體、GFAP(1∶400)抗體，4℃孵育過(guò)夜；次日于37℃下避光孵育熒光二抗；使用DAPI溶液染核，滴加抗熒光淬滅封片劑，于倒置熒光顯微鏡下觀察NVU各個(gè)組成部分的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1對(duì)神經(jīng)功能缺損的影響 mNSS評(píng)分結(jié)果顯示，假手術(shù)組神經(jīng)功能〔(0.0±0.0)分〕正常；模型組神經(jīng)功能〔(13.0±1.2)分〕缺損嚴(yán)重；與模型組比較，依達(dá)拉奉組〔(5.5 ± 1.4)分〕、黃芪甲苷組〔(8.0 ± 1.3)分〕、川芎嗪組〔(8.2 ± 1.8)分〕、配伍用藥組mNSS評(píng)分均顯著降低(P<0.01)，配伍用藥組改善程度優(yōu)于黃芪甲苷組和川芎嗪組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2對(duì)缺血半暗帶組織形態(tài)的影響 HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大腦皮層細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，排列致密有序，核仁清晰可見(jiàn)；模型組出現(xiàn)大面積壞死區(qū)域，細(xì)胞排列紊亂，結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，間質(zhì)水腫，呈高度疏松篩網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，部分細(xì)胞核固縮；黃芪甲苷組及川芎嗪組，缺血半暗帶組織形態(tài)較模型組顯著改善，壞死組織疏松篩網(wǎng)狀程度減輕，且配伍用藥組改善情況明顯優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用，見(jiàn)圖1。

2.3對(duì)缺血半暗帶Nissl染色的影響 假手術(shù)組大鼠腦缺血半暗帶Nissl體數(shù)目豐富，體積大，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常；模型組Nissl體數(shù)量顯著減少，神經(jīng)元皺縮變形，結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，排列不規(guī)則；與模型組比較，各治療組Nissl體數(shù)目顯著增加，染色加深，體積增大，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)改善，且配伍用藥組效果優(yōu)于黃芪甲苷或川芎嗪組，見(jiàn)圖2。

2.4對(duì)NVU各個(gè)組成部分的影響

2.4.1對(duì)NVU內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響 假手術(shù)組內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)豐富，血管表現(xiàn)為連續(xù)的線(xiàn)條狀，分布密集；與假手術(shù)組比較，模型組內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)，血管分布稀疏，連續(xù)性差；與模型組比較，黃芪甲苷及川芎嗪可顯著上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)(P<0.05，P<0.01)，改善血管形態(tài)，且配伍用藥組改善程度優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用(P<0.01)，見(jiàn)圖3，表1。

2.4.2對(duì)NVU周細(xì)胞損傷的影響 與假手術(shù)組比較，模型組腦缺血半暗帶PDGFRβ陽(yáng)性表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)，周細(xì)胞損傷嚴(yán)重；與模型組比較，各用藥組顯著改善腦缺血半暗帶周細(xì)胞損傷，上調(diào)PDGFRβ陽(yáng)性表達(dá)(P<0.01)，且配伍用藥組療效顯著優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用(P<0.01)，見(jiàn)表1，圖4。

圖1 黃芪甲苷與川芎嗪對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠缺血半暗帶組織形態(tài)改變的影響(HE染色，×200)

圖2 黃芪甲苷與川芎嗪對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠缺血半暗帶Nissl染色的影響(Nissl染色，×200)

圖3 黃芪甲苷與川芎嗪對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠缺血半暗帶內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的影響(IF，×200)

表1 黃芪甲苷與川芎嗪對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠缺血半暗帶NVU組成部分的影響

圖4 黃芪甲苷與川芎嗪對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠缺血半暗帶PDGFRβ表達(dá)的影響(IF，×200)

2.4.3對(duì)NVU神經(jīng)元損傷的影響 假手術(shù)組NeuN陽(yáng)性細(xì)胞豐富，分布均勻；與假手術(shù)組比較，模型組NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.01)，神經(jīng)元排列紊亂，分布稀疏；與模型組比較，黃芪甲苷及川芎嗪干預(yù)后，NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.01)；配伍用藥組NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著多于黃芪甲苷組、川芎嗪組(P<0.01)，見(jiàn)表1，圖5。

2.4.4對(duì)NVU星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦缺血半暗帶GFAP陽(yáng)性細(xì)胞增生肥大，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目增加(P<0.01)，星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化；與模型組比較，黃芪甲苷及川芎嗪顯著抑制了GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的增生肥大，下調(diào)活化細(xì)胞數(shù)目(P<0.01)，且配伍用藥組療效優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用(P<0.01)，見(jiàn)表1，圖6。

圖5 黃芪甲苷與川芎嗪對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠缺血半暗帶神經(jīng)元表達(dá)的影響(IF，×200)

圖6 黃芪甲苷與川芎嗪對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠缺血半暗帶GFAP表達(dá)的影響(IF，×200)

2.4.5對(duì)NVU小膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響 假手術(shù)組小膠質(zhì)細(xì)胞呈胞體較小、分枝較長(zhǎng)的分枝狀；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦缺血半暗帶Iba1陽(yáng)性細(xì)胞胞體增大，突起變短，呈阿米巴狀，表達(dá)數(shù)明顯升高(P<0.01)，小膠質(zhì)細(xì)胞極化程度高；與模型組比較，黃芪甲苷及川芎嗪顯著抑制小膠質(zhì)細(xì)胞極化，改善阿米巴狀變化，下調(diào)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)(P<0.01)，且配伍用藥效果優(yōu)于黃芪甲苷或川芎嗪?jiǎn)斡?P<0.01)，見(jiàn)表1，圖7。

圖7 黃芪甲苷與川芎嗪對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠缺血半暗帶Iba1表達(dá)的影響(IF，×200)

3 討 論

NVU由神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞組成，隨著腦卒中的治療策略由僅關(guān)注“神經(jīng)保護(hù)”轉(zhuǎn)變?yōu)殛P(guān)注腦卒中病程涉及的“多細(xì)胞保護(hù)”〔11〕，NVU在腦卒中恢復(fù)中發(fā)揮的作用越來(lái)越受到重視〔12〕。對(duì)NVU所有組成部分的關(guān)注、對(duì)多細(xì)胞間信號(hào)及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的信號(hào)傳導(dǎo)的研究，對(duì)于闡明缺血性腦卒中至關(guān)重要。中藥具有多組分、多靶點(diǎn)、多機(jī)制的作用特點(diǎn)，符合NVU多細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能特點(diǎn)及“多細(xì)胞保護(hù)”治療策略。

NVU強(qiáng)調(diào)多細(xì)胞在結(jié)構(gòu)與功能上的相互支持，其中內(nèi)皮細(xì)胞是腦微血管的主要組成部分，其結(jié)構(gòu)及功能的完整直接影響腦部微循環(huán)，在腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元的恢復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用；周細(xì)胞覆蓋于微血管內(nèi)皮細(xì)胞周?chē)⑶度氲侥X血管之外的基底膜〔13〕，與內(nèi)皮細(xì)胞共同參與維持BBB結(jié)構(gòu)與功能，并能調(diào)節(jié)毛細(xì)血管收縮和舒張，參與調(diào)節(jié)血管生成及免疫反應(yīng)等。周細(xì)胞損傷后，BBB結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)異?！?4〕，可引起凝血酶原、纖維蛋白原等血清蛋白及神經(jīng)元或血管損傷后釋放的其他毒性物質(zhì)進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)，并促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞極化水平，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥反應(yīng)〔15〕；小膠質(zhì)細(xì)胞作為神經(jīng)系統(tǒng)中重要的免疫細(xì)胞，維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，參與炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在腦缺血再灌注損傷后免疫和炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用〔16〕，有研究〔17〕認(rèn)為極化后的小膠質(zhì)細(xì)胞由分枝狀轉(zhuǎn)變?yōu)椤鞍⒚装蜖睢?，可釋放炎癥介質(zhì)并募集炎癥細(xì)胞，加劇腦缺血再灌注損傷；也有研究〔18〕發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞具有高度可塑性，受特定的微環(huán)境刺激可呈現(xiàn)不同表型，進(jìn)而發(fā)揮損傷和修復(fù)的雙重功能；星形膠質(zhì)細(xì)胞是膠質(zhì)細(xì)胞另一重要成員，作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)最豐富的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，可參與維持離子穩(wěn)態(tài)、神經(jīng)遞質(zhì)清除及神經(jīng)元的能量供應(yīng)，與突觸在結(jié)構(gòu)上有密切聯(lián)系〔19〕，并且與神經(jīng)元及血管細(xì)胞連接，以提供對(duì)大腦更多功能的廣泛控制。星形膠質(zhì)細(xì)胞不僅在生理?xiàng)l件下參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元功能，并對(duì)病理?xiàng)l件下腦功能發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，腦缺血再灌注損傷可激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，由靜息狀態(tài)向活化狀態(tài)轉(zhuǎn)變，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞稱(chēng)之為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，出現(xiàn)胞體肥大、中間絲蛋白表達(dá)水平增高等細(xì)胞形態(tài)和功能的變化，過(guò)度活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血再灌注損傷后引發(fā)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用〔20〕。中醫(yī)認(rèn)為，氣虛血瘀是缺血性腦卒中的主要病理機(jī)制之一〔21〕，益氣活血法可顯著改善缺血性腦卒中神經(jīng)功能損傷，但對(duì)NVU多細(xì)胞保護(hù)作用及機(jī)制尚不明確。益氣活血代表中藥黃芪及川芎已廣泛應(yīng)用在腦卒中的臨床治療中，黃芪為補(bǔ)中益氣要藥，《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》曰：“能補(bǔ)氣，兼能升氣”，其主要有效成分黃芪甲苷可通過(guò)調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體能量代謝、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管新生等多個(gè)環(huán)節(jié)改善腦缺血再灌注損傷〔22〕；川芎為“血中之氣藥”，并能“上行頭目”，《神農(nóng)本草經(jīng)》言其“主中風(fēng)入腦，頭痛”，《長(zhǎng)沙藥解》言其能“行經(jīng)脈之閉塞”，研究表明〔23〕，其主要有效成分川芎嗪可通過(guò)抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)血小板黏附、促進(jìn)神經(jīng)再生等途徑改善缺血性腦損傷。

本研究通過(guò)線(xiàn)栓法誘導(dǎo)大鼠腦缺血再灌注損傷，采用黃芪甲苷及川芎嗪組分配伍應(yīng)用。黃芪甲苷及川芎嗪干預(yù)后，可顯著改善腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺損及缺血半暗帶組織形態(tài)學(xué)改變，改善腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞及周細(xì)胞損傷，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化及小膠質(zhì)細(xì)胞極化程度，促進(jìn)神經(jīng)元損傷修復(fù)，進(jìn)而改善MCAO/R大鼠NVU結(jié)構(gòu)及功能，且二藥配伍應(yīng)用治療效果優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用。