miR-193a調控WT1影響高糖誘導的小鼠足細胞凋亡

高飛 張欣欣， 陳素枝 楊鳳文 檀金川,

(1河北中醫學院，河北 石家莊 050200；2河北省中醫院)

糖尿病腎病(DN)以蛋白尿和進行性腎衰竭為主要臨床表現，是我國終末期腎臟病的主要病因之一〔1〕。足細胞的功能和形態學改變與DN尿蛋白的增加關系密切，DN足細胞損傷后發生肥大、間質轉化、脫離和凋亡等，其中足細胞的過度凋亡是DN發生的重要原因〔2〕。由高糖誘導的足細胞凋亡是目前研究DN足細胞損傷發生機制的常用細胞模型〔3〕。研究表明微小RNA(miRNA)與足細胞損傷的發生關系密切，足細胞中miRNA的表達異?！?〕。miR-193a可促進心肌缺血/再灌注損傷細胞凋亡，促進肝癌細胞、前列腺癌細胞、非小細胞肺癌和腎癌細胞等凋亡〔5～7〕。研究報道miR-193a在DN患者腎組織中高表達，且miR-193a的表達水平與DN病變程度正相關〔8〕?，F階段對于miR-193a在高糖誘導的足細胞中的作用尚不清楚。本研究旨在探討miR-193a在高糖誘導的小鼠足細胞凋亡中的作用和機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 小鼠腎足細胞MPC-5購自上海雅吉生物科技有限公司；高糖培養基、Lipofectamine 3000購自Thermo Fisher公司；聚合酶鏈反應(PCR)引物由Servicebio公司合成；miR-NC inhibitor、miR-193a inhibitor、miR-NC mimic和miR-193a mimic由RiboBio公司合成。腎母細胞瘤(WT)1抗體購自ABclonal公司；酶切半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體購自武漢賽維爾生物科技有限公司；逆轉錄試劑盒購自Thermo公司；通用型快速啟動液購自Servicebio公司；熒光素酶報告載體由上海吉凱基因有限公司構建。

1.2細胞培養 小鼠腎足細胞MPC-5培養方法參照文獻〔9〕。細胞增殖：在33℃，5%CO2培養箱用含有10%胎牛血清(FBS)、20 U/ml 干擾素(IFN)-γ、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養基培養未分化足細胞。細胞分化：1∶10傳代，在37℃，5%CO2培養箱用含有10%FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養基培養足細胞10～14 d。

1.3實驗分組及轉染 將足細胞分為6組：正常糖組(5.5 mmol/L葡萄糖)；高糖組(30 mmol/L葡萄糖)；miR-193a inhibitor組、miR-NC inhibitor組、miR-193a mimic組和miR-NC mimic組。其中后4組足細胞分別轉染miR-193a inhibitor、miR-NC inhibitor、miR-193a mimic和miR-NC mimic質粒后在30 mmol/L的高糖培養基培養24 h。

1.4流式細胞術測定足細胞凋亡 胰酶-EDTA消化足細胞后室溫離心(1 000 r/min，5 min)，棄上清，1×磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌。每組收集大約1×106個足細胞，加入500 μl結合緩沖液，反復吹打均勻，分別添加5μl碘化丙啶(PI)和膜聯蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)混勻后在暗室靜置10 min，流式細胞儀檢測足細胞凋亡。

1.5逆轉錄(RT)-qPCR 抽提各組足細胞總RNA，使用Nanodrop 2000檢測RNA濃度及純度。取10 μl RNA溶液，加入特異性引物，加去離子水，加反應緩沖液、三磷酸脫氧核苷酸混合液、RNA酶抑制劑和逆轉錄酶于PCR儀進行反轉錄。配制PCR體系，進行PCR擴增，使用ΔΔCT法計算miRNA表達水平。miR-193a：上游引物5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGT-CATCTTG，下游5′-ACACTCCAGCTGGGTGGGTCT-TTGCGGGCA-3′；內參U6：上游引物5′-CTC-GCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATT-TGCGT-3′；WT1：上游引物5′-GTGGCTCCTGCGT-TTCCCCC-3′，下游5′-CCACAGGCATG GCGCGG-3′。反應擴增條件：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 60 s，循環40次。

1.6Western印跡 使用添加苯甲基磺酰氟(PMSF)的放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液提取總蛋白，使用二喹啉甲酸(BCA)測定蛋白濃度，取50 μg總蛋白與上樣緩沖液混合后100℃變性5 min，使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠90 V恒壓電泳2～3 h，之后進行250 mA恒流聚偏氟乙烯(PVDF)轉膜30～60 min。將PVDF膜放在5%牛血清白蛋白(BSA)37℃孵育1.5 h，加入一抗WT1(1∶5 000)、酶切caspase-3(1∶2 000)、Bax (1∶3 000)、Bcl-2(1∶2 000)和β-actin (1∶5 000)，4℃孵育過夜。洗膜后加入相應二抗(1∶5 000)，37℃孵育1 h。洗膜后使用電化學發光(ECL)法顯色，用Quantity One軟件分析條帶的灰度值，以目的蛋白條帶/β-actin條帶灰度比值作為最終結果。

1.7靶基因預測及熒光素酶報告系統鑒定 TargetScan數據庫(http://www.targetscan.org/vert_72/)預測WT1是miR-193a的靶基因，miR-193a與WT1的3′UTR端存在互補結合位點。分別構建突變型(MUT)和野生型(WT) WT1-3′UTR，并連接到psi-Check2載體，構建WT1-3′UTR WT和WT1-3′UTR Mut。足細胞接種在24孔板24 h后，用Lipofectamine 3000分別將WT1-3′UTR WT、WT1-3′UTR Mut與miR-193a mimics、miR-NC mimics共轉染至足細胞中，繼續培養24 h以后，使用Dual-Luciferase?雙熒光素酶報告分析系統檢測熒光素酶活性，以海參的熒光素酶熒光強度/螢火蟲的值來判定miR-193a與WT1的結合力。

1.8統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1miR-193a inhibitor下調高糖誘導的足細胞中miR-193a的表達水平 高糖組miR-193a水平(3.42±0.38)較正常糖組(0.09±0.07)顯著升高(P<0.05)，miR-193a inhibitor轉染高糖培養的足細胞后，細胞中的miR-193a表達水平(1.83±0.20)較高糖組顯著降低(P<0.05)。

2.2miR-193a 對高糖誘導的足細胞凋亡的影響 與正常糖組相比，高糖刺激小鼠足細胞后細胞凋亡率、酶切caspase-3和Bax蛋白水平顯著升高，Bcl-2蛋白水平顯著下降(P<0.05)；轉染miR-193a inhibitor后，高糖誘導的足細胞凋亡率、酶切caspase-3和Bax蛋白水平顯著降低，Bcl-2蛋白水平顯著升高(P<0.05)；轉染miR-193a mimic后，高糖誘導的足細胞凋亡率、酶切caspase-3和Bax蛋白水平顯著升高，Bcl-2蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見圖1、圖2、表1。表明miR-193a inhibitor抑制高糖誘導的足細胞凋亡，而miR-193a mimic促進高糖誘導的足細胞凋亡。

1～6：正常糖組，高糖組，miR-NC inhibitor組,miR-193a inhibitor組,miR-NC mimic組,miR-193a mimic組，下圖同圖1 Western印跡檢測各組凋亡蛋白

圖2 各組凋亡流式細胞圖

表1 miR-193a 對高糖誘導的足細胞凋亡的影響

2.3miR-193a靶向調控WT1在足細胞中的表達 通過TargetScan 預測miR-193a和 WT1的結合位點，見圖3。分別構建WT1突變型(MUT)和野生型(WT)載體，與miR-193a mimics、miR-NC mimics共轉染足細胞。結果顯示：與miR-NC組 mimic相比，miR-193a mimic組可顯著降低轉染WT1-3′UTR WT的足細胞的相對熒光活性(P<0.05)，而對WT1-3′UTR Mut的相對熒光活性無明顯影響(P>0.05)，見表2。

圖3 miR-193a和WT1結合位點

表2 熒光素酶活性實驗

2.4miR-193a inhibitor上調高糖誘導的足細胞中WT1的表達 與正常糖組相比，高糖組WT1 mRNA和蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。miR-193a inhibitor轉染后WT1 mRNA和蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，而miR-193a mimic轉染后WT1 mRNA和蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，見圖4、表3。表明miR-193a負向調控WT1蛋白的表達。

1～6：正常糖組，高糖組，miR-NC inhibitor組,miR-193a inhibitor組,miR-NC mimic組,miR-193a mimic組圖4 miR-193a inhibitor上調高糖誘導的足細胞中WT1蛋白的表達

表3 miR-193a inhibitor上調高糖誘導的足細胞中WT1的表達

2.5miR-193a 靶向調控WT1抑制高糖誘導的足細胞凋亡 miR-193a+WT1組凋亡率、酶切caspase-3、Bax顯著低于miR-193a+Vector組，WT1、Bcl-2水平顯著高于miR-193a+vector組(均P<0.05)。見表4、圖5，表明上調WT1可降低miR-193a對高糖誘導的足細胞凋亡的影響。

表4 miR-193a 調控WT1抑制高糖誘導的足細胞凋亡

圖5 miR-193a 靶向調控WT1抑制高糖誘導的足細胞凋亡

3 討 論

足細胞是維持腎小球濾過膜結構和功能的主要細胞，足細胞損傷后蛋白從濾過膜漏出形成蛋白尿〔10〕。足細胞凋亡是足細胞數量減少和密度減低的重要原因之一。研究表明高水平葡萄糖刺激細胞線粒體釋放大量活性氧基團，直接或間接導致足細胞凋亡，也可以通過腎素-血管緊張素-醛固酮系統、轉化生長因子-β1 等多種信號通路介導足細胞凋亡〔11〕。

miR-193a是一種具有多種生物學作用的miRNA分子，在各種疾病的作用受到關注。如肝癌、前列腺癌、非小細胞肺癌和腎癌等多種類型癌癥〔5～7〕。例如miR-193a通過靶向細胞外基質蛋白多糖(SPOCK)1抑制肝細胞癌的生長〔12〕，通過下調PLAU表達抑制大腸癌細胞的增殖和進展〔13〕。此外，miR-193a可減輕肝纖維化并抑制肝星狀細胞的增殖和活化〔14〕，通過靶向負調控高遷移率族蛋白(HMGB)1減輕糖尿病模型小鼠神經性疼痛〔15〕。除了影響癌癥，miR-193a與膜性腎病、局灶節段性腎小球硬化(FSGS)和DN等多種腎臟疾病的發生發展密切相關〔16～18〕。如Zhang等〔16〕研究發現，特發性膜性腎病患者的miR-193a高表達，同時高表達miR-193a與高蛋白尿(>3.79 g/24 h)、高血清肌酐>174.63 μmol/L)和腎小球濾過率下降〔≤68.13 ml/(min·1.73 m2)〕均為膜性腎病的腎存活不良的生物標志物，也是預測膜性腎病預后的生物標志物。Huang等〔17〕觀察到FSGS患者的尿液外泌體miR-193a水平明顯高于微小病變患者，提示miR-193a可能是診斷原發性FSGS非侵入性生物標志物。研究發現腎病綜合征患者血清中miR-193a也是增加的〔19〕。足細胞分子表型的喪失是DN的重要特征。高糖誘導的足細胞去分化表現為WT1下調和配對框(PAX)2表達上調。Abheepsa等〔20〕研究顯示，高糖誘導的足細胞去分化與miR-193a的高表達有關，而抑制miR-193a則阻止了高糖環境中足細胞的去分化。足細胞分化的喪失也可引起腎病范圍蛋白尿及FSGS，這與miR193a的高表達也存在相關性〔21〕。

研究表明，包括miR-193a在內的miRNA可與多個靶基因結合發揮多種生物學作用，HMGB1〔22〕、生長因子受體結合蛋白(GRB)7〔23〕、早老素(PSEN)1〔24〕和鼠肉瘤原癌基因(KRAS)〔25〕等均是miR-193a的靶基因，參與人體不同組織細胞的病理和生理過程。WT1是成熟足細胞的特異性標志蛋白，常作為足細胞計數的標記物，對足細胞的發育，分化和穩態至關重要〔26〕。WT1通過調節裂隙膜nephrin和podocalyxin及足細胞特異性轉錄因子來維持足細胞結構和功能的穩態〔19〕。當足細胞受到損傷時，WT1表達降低。此外，WT1也是一個與細胞凋亡有關的抗凋亡因子，其可通過多種途徑抑制細胞凋亡的發生。如WT1通過靶向cMyc增強KRAS突變型非小細胞肺癌(NSCLC)的增殖并阻止其凋亡〔27〕；通過調控上游激活劑Bax及調控下游效應子酶切caspase-3和caspase-7抗細胞凋亡〔28〕；通過抑制EZH2/β-catenin途徑改善DN的足細胞損傷等〔26〕。Li等〔29〕研究顯示，高果糖誘導足細胞凋亡模型中miR-193a高表達，WT1低表達，高果糖可通過增加miR-193a的表達從而下調WT1的表達，促進足細胞凋亡，而異甘草酸鎂可以逆轉這一過程。本研究結果提示miR-193a可通過靶向負調控WT1的表達影響酶切caspase-3和Bax等凋亡信號通絡，從而減少高糖誘導的足細胞凋亡。