白術(shù)提取物調(diào)控miR-96抑制AngⅡ誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

楊燕 楊新 李秀芬 比拉里

(1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院心內(nèi)科，新疆 烏魯木齊 830000；2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院心電學(xué)科)

血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)主要功能是血管收縮，其異常增殖導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化(AS)斑塊的形成，VSMCs的表型轉(zhuǎn)換可促進(jìn)AS的慢性炎癥發(fā)生〔1〕。中藥方劑或提取物可有效阻止AS斑塊形成或改善損傷〔2〕，研究其抑制機(jī)制可能發(fā)現(xiàn)AS的分子治療靶點(diǎn)。血管緊張素(Ang)Ⅱ是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的主要活性肽激素。它在內(nèi)皮功能障礙，血管重塑和血管炎癥中起作用，這與包括AS和高血壓在內(nèi)的多種疾病密切相關(guān)〔3〕。半夏白術(shù)天麻顆粒在治療頸AS痰濁阻絡(luò)證的臨床療效上安全有效〔4〕，且含有白術(shù)等多種中藥的理脾化痰方可抗早期AS及抑制VSMC增殖〔5〕，白術(shù)水煎液可以保護(hù)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞免受過(guò)氧化氫損傷，對(duì)血管相關(guān)病變具有一定的預(yù)防和治療作用〔6〕。目前白術(shù)對(duì)VSMC的影響機(jī)制尚不清楚。有研究表明，miR-96在AS患者中高表達(dá)〔7〕，miR-96為骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)調(diào)節(jié)VSMC收縮表型的調(diào)節(jié)劑，BMP作用VSMC可使miR-96表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而維持VSMC收縮表型〔8〕。本研究探討白術(shù)提取物對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的人臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HUASMCs)的增殖、遷移和侵襲的影響及潛在分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 HUASMCs購(gòu)自北納生物；白術(shù)飲片購(gòu)自中藥材市場(chǎng)，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中藥師鑒定為白術(shù)根莖；AngⅡ購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白酶、牛血清白蛋白(BSA)、二甲基亞鋼(DMSO)和四氮唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司；Transwell板購(gòu)自美國(guó)Corning公司；引物、miR-96 mimics(miR-96)、miR-96抑制物(anti-miR-96)和陰性對(duì)照(miR-con和anti-miR-con)購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、RNA提取試劑TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT-PCR) 和real-time PCR 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體、p21抗體、鼠抗人E鈣黏附蛋白單克隆抗體(E-cadherin)抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2抗體和GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；顯微鏡、酶標(biāo)儀及Real-time PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2白術(shù)提取物的制備〔9〕根據(jù)文獻(xiàn)〔9〕制備白術(shù)提取物，將100 g白術(shù)飲片粉碎，加入500 ml甲醇，超聲提取30 min，重復(fù)3次，紗布過(guò)濾，合并濾液。將濾液進(jìn)行0.22 μm濾膜過(guò)濾，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，真空干燥，得白術(shù)提取物干粉10 g。實(shí)驗(yàn)時(shí)配制成磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液，過(guò)濾除菌備用。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)、藥物處理〔5,8〕細(xì)胞培養(yǎng)：將HUASMCs細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS、1% 青-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在濕度95%、37℃ 且5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，消化傳代。

藥物處理：將AngⅡ溶解于PBS配制成1×103mol/L并過(guò)濾除菌，使用時(shí)加入培養(yǎng)液中，配制成所需濃度。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用1×107mol/L AngⅡ處理HUASMCs 48 h，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將AngⅡ誘導(dǎo)后的HUASMCs細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)過(guò)夜，然后加入終濃度為125 ng/ml、250 ng/ml和500 ng/ml的白術(shù)提取物，對(duì)照組加入空白培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24～72 h，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 用DMEM高糖培養(yǎng)液稀釋對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUASMCs，以2×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)細(xì)胞待細(xì)胞至融合度為80～90%，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書操作將anti-miR-con、anti-miR-96、miR-con和miR-96轉(zhuǎn)染HUASMCs，轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染分組：miR-96抑制組(轉(zhuǎn)染anti-miR-con和anti-miR-96)、miR-96過(guò)表達(dá)組(轉(zhuǎn)染miR-con和miR-96)。

1.5qRT-PCR檢測(cè)RNA表達(dá) 收集各組AngⅡ誘導(dǎo)、經(jīng)白術(shù)提取物處理或(和)轉(zhuǎn)染的HUASMCs，用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板按照 real-time PCR的說(shuō)明書進(jìn)行反應(yīng)合成miR-96，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 4 min；94℃ 30 s、59℃ 40 s、72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。miR-96引物序列為5′-CTGCCTTGAGTGCTCCTA-3′(上游)和5′-CCTGACACAAGGATGCAG-3′(下游)。用2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率 收集AngⅡ處理后、白術(shù)提取物處理和(或)轉(zhuǎn)染的HUASMCs，胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞并稀釋，以2×103個(gè)/孔接種于96微孔板中，培養(yǎng)液中加入白術(shù)提取物(終濃度分別為125 ng/ml、250 ng/ml和500 ng/ml)，對(duì)照組中加入等體積的空白培養(yǎng)液，待細(xì)胞培養(yǎng)至24、48、72 h時(shí)進(jìn)行 MTT 實(shí)驗(yàn)，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm 吸光度(A)值。存活率=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%，抑制率=100%-存活率。

1.7Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 遷移實(shí)驗(yàn)：收集轉(zhuǎn)染或處理后的各組HUASMCs，用含無(wú)血清DMEM高糖培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋為2×105個(gè)/ml。取100 μl細(xì)胞加入24孔Transwell上層小室，同時(shí)加入實(shí)驗(yàn)濃度的白術(shù)提取物，對(duì)照中加入等體積的空白培養(yǎng)液，下層小室加入500 μl含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，將上層小室放入下層小室中，培養(yǎng)24 h，取出上層小室，棄培養(yǎng)液，洗滌2遍，用棉簽擦去上層小室未遷移的細(xì)胞，甲醛固定細(xì)胞10 min，結(jié)晶紫染色30 min，顯微鏡計(jì)數(shù)5個(gè)視野，取均值。

侵襲實(shí)驗(yàn)：將液化過(guò)夜的Matrigel用培養(yǎng)液1∶3比例稀釋，取100 μl加入上層小室，在超凈工作臺(tái)過(guò)夜固化，上層加入稀釋的細(xì)胞和白術(shù)提取物，下層加入含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液。其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.8Western印跡實(shí)驗(yàn) 收集轉(zhuǎn)染、AngⅡ處理或(和)白術(shù)提取物處理的各組HUASMCs，裂解細(xì)胞并超聲破碎，離心收集蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酶胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白條帶，轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PVDF)膜，脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入一抗，CyclinD1抗體(1∶3 000)、p21抗體(1∶2 000)、E-cadherin抗體(1∶2 000)、MMP-2抗體(1∶2 000)和GAPDH抗體(1∶5 000)，4℃過(guò)夜孵育。洗膜2次后加入稀釋的酶標(biāo)二抗，室溫孵育2 h。以GAPDH為內(nèi)參照，Quantityone軟件進(jìn)行圖像分析，以目的蛋白與內(nèi)參照蛋白條帶灰度值之比來(lái)分析蛋白水平。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析。

2 結(jié) 果

2.1白術(shù)提取物抑制AngⅡ誘導(dǎo)的HUASMC增殖 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇具有最佳的促增殖作用的1×107mol/L AngⅡ刺激HUASMCs 48 h。與對(duì)照組相比，AngⅡ組HUASMCs中CyclinD1表達(dá)明顯升高，p21蛋白表達(dá)明顯降低，細(xì)胞OD值在24 h、48 h和72 h均顯著升高(P<0.05)。與AngⅡ組相比，AngⅡ+白術(shù)提取物125 ng/ml組、AngⅡ+250 ng/ml組和AngⅡ+500 ng/ml組HUASMCs中CyclinD1表達(dá)明顯下降，p21蛋白表達(dá)升高，細(xì)胞OD值在24 h、48 h和72 h均顯著下降(均P<0.05)，且均呈現(xiàn)顯著的劑量依賴趨勢(shì)，見(jiàn)表1和圖1。說(shuō)明白術(shù)提取物可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的HUASMCs增殖。根據(jù)結(jié)果，選擇對(duì)HUASMCs抑制率約為50%的白術(shù)提取物250 ng/ml濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 白術(shù)提取物對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的HUASMC增殖的影響

1)與對(duì)照組比較；2)與AngⅡ組比較；3)與AngⅡ+白術(shù)提取物125 ng/ml組比較,4)與AngⅡ+白術(shù)提取物250 ng/ml組比較:均P<0.05

1～5：對(duì)照組，AngⅡ組,AngⅡ+白術(shù)提取物125 ng/ml組，ANGⅡ+白術(shù)提取物250 ng/ml組,AngⅡ+白術(shù)提取物500 ng/ml組圖1 白術(shù)提取物對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的HUASMC增殖蛋白表達(dá)的影響

2.2白術(shù)提取物抑制AngⅡ誘導(dǎo)的HUASMC遷移和侵襲 與對(duì)照組相比，AngⅡ組HUASMCs中MMP-2表達(dá)明顯升高，E-cadherin蛋白表達(dá)明顯降低，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著增多(均P<0.05)；與AngⅡ組相比，AngⅡ+白術(shù)提取物250 ng/ml組HUASMCs中E-cadherin表達(dá)明顯升高，MMP-2蛋白表達(dá)明顯降低， 遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著下降(均P<0.05)，見(jiàn)圖2和表2。

2.3白術(shù)提取物抑制AngⅡ誘導(dǎo)的HUASMC中miR-96表達(dá) 與對(duì)照組(0.25±0.02)相比，AngⅡ組HUASMCs中miR-96表達(dá)顯著升高(0.88±0.09，P<0.05)；與AngⅡ組相比，AngⅡ+白術(shù)提取物250 ng/ml組HUASMCs細(xì)胞中miR-96表達(dá)顯著降低(0.34±0.03，P<0.05)。

2.4抑制miR-96可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的HUASMC增殖、遷移和侵襲 與AngⅡ+anti-miR-NC組相比，AngⅡ+anti-miR-96組HUASMC中miR-96、CyclinD1和MMP-2表達(dá)顯著降低，p21和E-cadherin表達(dá)顯著升高，細(xì)胞OD值在24 h、48 h和72 h、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低(均P<0.05)，見(jiàn)圖3、表4。

2.5過(guò)表達(dá)miR-96能逆轉(zhuǎn)白術(shù)提取物對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞HUASMC增殖的影響 與AngⅡ+白術(shù)提取物250 ng/ml+ miR-NC組相比，AngⅡ+白術(shù)提取物250 ng/ml+miR-96組細(xì)胞中miR-96表達(dá)顯著升高，CyclinD1表達(dá)明顯升高，p21表達(dá)明顯降低，細(xì)胞OD值在24 h、48 h和72 h均顯著升高(均P<0.05)，見(jiàn)表5、圖4。

圖2 白術(shù)提取物對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的HUASMC遷移、侵襲的影響(結(jié)晶紫染色)

1，2：AngⅡ+anti-miR-NC組,AngⅡ+anti-miR-96組

圖3 抑制miR-96對(duì)AngⅡ作用的HUASMC增殖遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響(結(jié)晶紫染色)

表4 抑制miR-96對(duì)AngⅡ作用的HUASMC增殖、遷移、侵襲的影響

表5 過(guò)表達(dá)miR-96能逆轉(zhuǎn)白術(shù)提取物對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的HUASMC增殖的影響

1，2：AngⅡ+白術(shù)提取物250 ng/ml+miR-NC組,AngⅡ+白術(shù)提取物250 ng/ml+miR-96組；圖5同圖4 過(guò)表達(dá)miR-96能逆轉(zhuǎn)白術(shù)提取物對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的HUASMC增殖蛋白表達(dá)的影響

2.6過(guò)表達(dá)miR-96能逆轉(zhuǎn)白術(shù)提取物對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的HUASMC遷移、侵襲的影響 與AngⅡ+白術(shù)提取物250 ng/ml+ miR-NC組相比，AngⅡ+白術(shù)提取物250 ng/ml+ miR-96組細(xì)胞中miR-96表達(dá)顯著升高，E-cadherin表達(dá)明顯降低，MMP-2表達(dá)明顯升高，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著增多(均P<0.05)，見(jiàn)圖5、表6。

圖5 過(guò)表達(dá)miR-96能逆轉(zhuǎn)白術(shù)提取物對(duì)AngⅡ作用的HUASMC遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響(結(jié)晶紫染色)

表6 過(guò)表達(dá)miR-96能逆轉(zhuǎn)白術(shù)提取物對(duì)AngⅡ作用的HUASMC遷移、侵襲的影響

3 討 論

VSMC的異常調(diào)控在AS的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要功能，了解VSMC在AS中的行為對(duì)于確定防治AS的治療靶點(diǎn)至關(guān)重要〔10〕。AngⅡ可通過(guò)激活血管NAD(P)H氧化酶來(lái)刺激活性氧的生成，從而引起血管多種生理病理作用，參與血管重塑、炎癥、鈣化和AS等過(guò)程〔11〕。AngⅡ常用于構(gòu)建AS體外血管模型〔3〕。白術(shù)是菊科植物白術(shù)的干燥根莖，一種常用的中藥材〔12〕。

白術(shù)有效成分主要是內(nèi)酯類、多糖、揮發(fā)油類和總黃酮物質(zhì)等，具有抑菌、抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)脂類代謝等功能〔13〕。白術(shù)揮發(fā)油成分對(duì)肝癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、乳腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞均具有不同程度的抑制作用〔14〕。白術(shù)還用于治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病，與其他方劑合用，可顯著提高臨床療效，改善心血管功能，提高生存質(zhì)量〔15,16〕。本研究所用的白術(shù)提取物包含揮發(fā)油和內(nèi)酯類成分〔9〕，本研究驗(yàn)證了白術(shù)提取物對(duì)可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的HUASMCs增殖、遷移和侵襲，說(shuō)明白術(shù)提取物對(duì)AS具有潛在抑制作用。

miR-96可能與血小板功能和反應(yīng)活性相關(guān)，而血小板活化在AS的發(fā)展和進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用，AS后期常出現(xiàn)致命缺血事件，因此miR-96可能是心血管疾病的潛在診斷和治療標(biāo)志物〔17〕。研究表明，miR-96-5p在AS患者中高表達(dá)，具體作用機(jī)制尚不清楚〔7〕。miR-96可顯著抑制肝細(xì)胞中高密度脂蛋白受體(SR-BI)的表達(dá)，SR-BI的過(guò)表達(dá)能有效促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)，減少AS的發(fā)生〔18〕。本研究認(rèn)為，白術(shù)提取物可能通過(guò)調(diào)控miR-96抑制AngⅡ誘導(dǎo)的HUASMCs增殖、遷移和侵襲。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，miR-96在AngⅡ誘導(dǎo)的HUASMCs中高表達(dá)，250 ng/ml白術(shù)提取物可逆轉(zhuǎn)AngⅡ?qū)UASMCs中miR-96表達(dá)的促進(jìn)作用，抑制miR-96表達(dá)；通過(guò)抑制和過(guò)表達(dá)miR-96發(fā)現(xiàn)，抑制miR-96表達(dá)可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的HUASMC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，過(guò)表達(dá)miR-96可逆轉(zhuǎn)白術(shù)提取物對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的HUASMCs細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，說(shuō)明白術(shù)提取物通過(guò)抑制miR-96表達(dá)來(lái)抑制AngⅡ誘導(dǎo)的HUASMCs細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。