六堡茶真菌多樣性分析和優勢真菌的分離篩選

楊 娟，陳欣怡，丁子元，田海霞，馬 躍，李 頌，鄭曉衛*

1. 中糧營養健康研究院有限公司/中糧生物科技（北京）有限公司，北京 102209；2. 中茶科技（北京）有限公司，北京 102209

六堡茶是一種產自廣西梧州市六堡鄉的黑茶，為后發酵茶，具有色澤黑褐、湯色紅濃明亮、香氣醇陳等特點，以“紅、濃、陳、醇”四絕著稱[1-2]。渥堆是六堡茶生產的關鍵步驟，在該過程中有大量的微生物生長繁殖，在濕熱作用和微生物分泌的酶系的作用下茶葉中的大分子物質如蛋白質、粗纖維、碳水化合物、脂肪及茶多酚等發生一系列的轉化，形成氨基酸、多糖、酯類及茶色素等，最終影響和形成了六堡茶的品質特點[3]。胡沛然[4]通過控制溫度條件，從渥堆茶葉中分離篩選嗜熱菌，共得到細菌5個屬14個種及霉菌5個屬9個種，最終篩選出3株產多酚氧化酶嗜熱菌，分別為傘狀毛霉菌（Lichtheimia corymbifera）、塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis）和煙曲霉（Aspergillus fumigatus）。另外，六堡茶素有“耐于久藏，越陳越好”的說法，陳化工藝是其呈現獨特的檳榔香氣的關鍵步驟[5]。陳慶金等[6]采用Miseq測序對六堡茶陳化初期的真菌多樣性進行分析，在97%的相似水平下分類出62個OUT，3個門、6個綱、9個目、8個科和9個屬，分析發現陳化6 d的茶樣微生物豐富度最高，其中曲霉屬和散囊菌屬是陳化初期的優勢菌屬。

目前六堡茶生產企業多采用渥堆發酵制作工藝，渥堆發酵菌種主要是來自原料或加工環境中的微生物，其種類和數量受到原料以及溫濕度等環境因素的影響，存在不同批次間產品微生物復雜多變、茶葉品質的穩定性不易控制等問題[7]；過程工藝控制不當也可能會引入無用的雜菌或產生毒素的有害菌，對成品茶的品質風味產生負面影響，嚴重的會引發安全問題。研究表明黑曲霉中的某些菌株能夠產生赭曲霉毒素A、伏馬毒素等[8-9]，塔賓曲霉、溜曲霉等能夠產生赭曲霉毒素[10]。目前關于發酵茶的毒素報道多集中于普洱茶[11-13]，對六堡茶中真菌毒素的研究較少，主要圍繞毒素檢測方法的建立，如劉妍等[14]建立了六堡茶、普洱茶等發酵黑茶的黃曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮等10種真菌毒素的超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法。

本試驗研究針對不同陳化后的六堡茶樣品，通過真菌多樣性分析結合傳統培養技術挖掘優勢真菌，評價優勢真菌酶活及毒素情況，以期進一步認識升級工藝后中茶新一代高品質六堡茶，解析核心有益微生物，為打造高品質六堡茶奠定重要基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于梧州當地茶廠共采集到9份具有代表性的六堡茶樣品，其中4份陳放一年、4份陳放三年、1份陳放十三年，樣品具體信息見表1。樣品采集后分為兩份，其中一份于-80℃保存用于基因組提取后進行高通量測序，另一份于4℃保存用于可培養方法分離。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

1.2 試劑與儀器

分離培養基：孟加拉紅培養基，購自北京陸橋技術股份有限公司。保存培養基：PDA培養基，購自北京陸橋技術股份有限公司。產淀粉酶培養基：可溶性淀粉2.0 g，蛋白胨2.0 g，酵母粉1.0 g，瓊脂2.0 g，蒸餾水100 mL，115℃滅菌20 min。產蛋白酶培養基：脫脂 2.0 g，瓊脂2.0 g，蒸餾水100 mL，115℃滅菌15 min。產纖維素酶培養基：CMC 1.0 g，蛋白胨1.0 g，酵母膏0.5 g，磷酸二氫鉀0.1 g，硫酸鎂0.02 g，氯化鈉1.0 g，瓊脂0.8 g，蒸餾水100 mL，115℃滅菌15 min。產脂肪酶培養基：酵母浸膏0.5 g，胰蛋白胨1.0 g，NaCl 1.0 g，橄欖油乳化液1.0，瓊脂粉2.0 g，蒸餾水100 mL，115℃滅菌20 min。產酯酶培養基：酵母浸膏1.0 g，蛋白胨2.0 g，葡萄糖2.0 g，三丁酸甘油酯1.5 mL，溴甲酚紫0.004 g，瓊脂2.0 g，蒸餾水100 mL，115℃滅菌20 min。

真菌DNA提取試劑盒、磁珠組織DNA提取試劑盒，購自美國Omega Bio-Tek公司；PCR引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

生物安全柜，ESCO；電熱恒溫培養箱，Thermo；SQ810C立式壓力蒸汽滅菌鍋，重慶雅馬拓科技有限公司；ME104型萬分之一天平，梅特勒-托利多公司；VORTEX 3圓周振蕩器，德國IKA公司；ZQZY-CF 9.9振蕩培養箱，上海知楚儀器有限公司；高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；微量核酸蛋白分析儀（BioDrop-μLite），英國Biochrom有限公司；一次性培養皿、接種環等。

1.3 試驗方法

1.3.1 茶樣DNA提取和高通量測序

將茶樣充分混勻，每份樣品隨機取樣3次，并用液氮充分研磨，利用百泰克磁珠組織DNA提取試劑盒提取茶樣的DNA，利用微量核酸蛋白分析儀檢測DNA的濃度及純度，利用Illumina公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250平臺對真菌翻譯間隔序列ITS1區進行測序（上海美吉生物醫藥科技有限公司）。

1.3.2 茶樣中真菌的分離純化

菌懸液的制備：分別準確稱取25 g茶樣，加入盛有225 mL生理鹽水的三角瓶內（瓶內放適當數量的無菌玻璃珠），室溫180 r/min充分振蕩30 min，即為1∶10的稀釋液；吸取1∶10樣品勻液1 mL，注入盛有9 mL生理鹽水的無菌試管中，手動震蕩30 s使液體混合菌液，制成1∶100的稀釋液，按照上述步驟依次制備10-3、10-4、10-5、10-6的梯度稀釋液。

菌株的分離純化：用無菌移液器分別吸取10-2～ 10-6濃度梯度的稀釋液100 μL，涂布于孟加拉紅平板培養基上，每個稀釋度3個平行，置于30℃的培養箱內恒溫培養。從第2天開始根據菌落表型特征挑取不同的單菌落進行劃線分純，多次劃線后得到純的菌株。分純后轉接PDA試管斜面并于4℃保存，同時光學顯微鏡下觀察菌株的形態學特征。

1.3.3 菌株DNA序列分析

將分離的純菌株接種到100 mL的PDB液體培養基中，180 r/min搖床培養3 d后收集菌體，利用百泰克真菌提取試劑盒進行基因組DNA的提取。將提取的基因組DNA送至上海生工技術有限公司分別利用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′） 和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）擴增真菌核糖體 RNA基因（即rDNA）的轉錄間隔區（Internal Transcribed Spacer, ITS），利用β-tubulin基因霉菌通用引物Bt2a （5'-GGTAACCAAATCGGTGCT GCTTTC-3'）和 Bt2b（5'-ACCCTCAGTGTAGTGACC CTTGGC-3')擴增β微管蛋白（β-tubulin）基因序列。測序完成后將測序結果提交GenBank數據庫，利用Blastn軟件進行同源序列比對，下載與目標菌株相近種的模式菌株序列作為參比菌，采用MEGA 7軟件用鄰位相連法（Neighborjoining）的算法構建供試菌與參比菌之間的系統發育樹。

1.3.4 菌株酶活測定

種子液制備：將分純得到的菌株挑取一環菌絲，分別接種到裝有2 mL YPD液體培養基的24孔板中，搖床培養10 h后作為測定酶活的種子液。

酶活測定：取種子液10 μL點接到各個酶活篩選培養基平板上測定酶活，每株菌3個平板，置于30℃恒溫培養箱培養48 h。淀粉酶活的測定需將稀碘液滴入平板染色30 min，觀察菌落周圍是否產生淀粉水解圈。纖維素酶活的測定需將1 mg/mL剛果紅溶液滴入平板染色30 min，蒸餾水漂洗后用1 mol/L NaCl溶液脫色30 min。五種酶活的測定均測量透明圈直徑（D）和菌落直徑（d），并計算其比值（D/d）。

1.3.5 毒素檢測

發酵液的制備：菌株接種于PDA瓊脂培養基上，30℃培養5 d。利用無菌打孔器在培養基上打孔，挑取4塊菌餅接種于PDB液體培養基中，30℃、200 rpm搖床培養3 d，得到的發酵液8000 rpm離心30 min后得到上清液備用。

茶葉樣品的前處理：分別稱取25 g茶葉樣品（精確至0.01 g），加入5 g NaCl，然后準確加入甲醇-水溶液（80+20）100 mL，振蕩器震蕩30 min后經定量濾紙過濾，移取10 mL濾液并加入40 mL PBS，玻璃纖維濾紙過濾至澄清，澄清液備用。

樣品的凈化：準確移取20 mL上清液，調節下滴速度，控制樣液以1 ～ 2滴/s的速度穩定下滴。待樣液流干，加入10 mL1%吐溫-20的PBS（4.2.4），流干后加入10 mL水，以穩定流速淋洗免疫親和柱。待水滴完后，用洗耳球抽干親和柱。在親和柱下部放置10 mL刻度試管，取下50 mL的注射器筒，依次準確加入1 mL甲醇、2 mL水洗脫親和柱，控制1 ～ 2滴/s的速度下滴，再抽干親和柱，收集全部洗脫液至試管中，渦旋30 s，過PTFE濾膜，收集濾液于進樣瓶中以備進樣。

毒素檢測：利用本實驗室建立的方法通過高效液相色譜對茶葉中常見的真菌毒素（黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、伏馬毒素以及桔青霉毒素）進行檢測。

2 結果與分析

2.1 高通量測序OTU分析結果

利用Uparse軟件對高通量測序得到的序列在97%相似度下對非重復序列進行OTU聚類分析，9個茶葉樣品共產生89個OTU，每個樣品測序得到的OTU數量、Shannon指數以及Simpson指數等見表2。Shannon和Simpson指數反映出六堡茶發酵過程真菌物種多樣性，指數越高說明群落多樣性越豐富，Chao是用chao1算法估計樣本中所含OTU數目的指數，Chao1在生態學中常用來估計物種總數，ACE用來估計群落中OTU數目的指數，這兩個指數反映出普洱茶發酵過程中真菌物種豐度，數值越大豐度越高。

表2 各樣品的OUT數量及多樣性指數Table 2 The OTU number and the diversity index of the sequencing results of each sample

由表2可知，未經過高溫蒸壓的茶葉樣品中的真菌多樣性較高（Y2020_00360除外），其中經渥堆發酵未蒸壓的兩個樣品Y2020_0901042和Y2018_701017的Shannon指數均較高，表明其中的微生物種類均較多。

2.2 真菌屬級單元多樣性及豐度

為得到每個OTU對應的物種分類信息，將上述聚類得到的89個OTU代表序列在真菌ITS數據庫（Unite）中進行比對和物種注釋，89個OTU歸屬于4個門、6個綱、6個目、8個科和8個屬，各樣品中屬水平的多樣性分布見圖1。由圖1可知，各樣品中豐度大于1%的屬級分類單元包括：曲霉屬（Aspergillus）、芽生葡萄孢酵母屬（Blastobotrys）、節擔菌屬（Wallemia）、青霉菌屬（Penicillium）、Rasamsonia、油壺菌屬（Olpidium），其中曲霉屬（Aspergillus）在Y2020_2、Y2018_60219、Y2020_023056等多個樣品中豐度達70%以上，為絕對優勢屬。

圖1 真菌屬級分列單元在各茶葉樣品中的分布情況Figure 1 The taxonomic composition distribution in tea samples at genus-level

2.3 物種聚類結果

各樣品間物種組成聚類分析結果詳見圖2。樣品間越靠近，枝長越短，說明兩個樣品的物種組成越相似。由圖2可知樣品Y2018_60219（經渥堆發酵和蒸壓）與其他樣品中真菌多樣性相差最遠，樣品Y2018_0068、Y2020_0901042、Y2018_701017、Y2020_023056以及Y2020_00360聚為一支，距離較近，該分組中大多數樣品為經過渥堆發酵但未經過蒸壓工藝；成品Y2018、Y2020以及Y2018_5501聚為一支，距離較近，該組樣品全部為成品。由此我們推斷六堡茶的發酵工藝會影響其真菌多樣性，并最終影響了六堡茶的品質特征，具體到各工藝階段的作用有待進一步研究。

圖2 樣品間的聚類分析結果Figure 2 Clustering results of samples

2.4 可培養真菌的分離與鑒定結果

利用可培養方法從9個六堡茶樣品中分離優勢真菌，共分離到優勢真菌純培養物20株，按照分離挑取單菌落時間順序分別編號為CHA1-CHA7和CHA9～CHA21，通過形態學與核酸序列分析可知分離到的霉菌全部為曲霉屬，與高通量測序結果吻合。根據菌株鑒定結果，20株菌株可以歸為2類，分別是塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis）、琉球曲霉（A.luchuensis），其菌落形態及顯微形態見圖3。

圖3 塔賓曲霉CHA11、琉球曲霉CHA12在PDA培養基上的宏觀形態及其對應的微觀形態Figure 3 Colony morphology and microscopic morphology of A. tubingensis CHA11 and A. luchuensis CHA12 on PDA

將PCR擴增測序得到的ITS rDNA序列在NCBI數據庫中利用BLASTn進行同源性比對，結果發現20株菌株的ITS rDNA序列與琉球曲霉、塔賓曲霉、A.costaricensis、A.piperis等的序列相似性均高于99%，利用該序列無法將這些菌株區分開，需要結合微管蛋白基因（β-tubulin）進行區分。

將基于ITS序列的測序序列在NCBI數據庫中利用BLAST進行序列比對分析，下載與目標菌株相近種的模式菌株β-tubulin基因序列，利用ClustalX 1.83進行多序列比對，在用MEGA 7.0進行鄰接法（neighbor joining）聚類系統發育及分子進化分析，結果如圖4所示。由圖4可知，菌株CHA1、CHA2、CHA4、CHA5、CHA6、CHA7、CHA9、CHA10、CHA12、CHA16、CHA17、CHA18、CHA19、CHA20、CHA21與琉球曲霉聚類于同一分枝上，菌株CHA3、CHA11、CHA13、CHA14、CHA15與塔賓曲霉聚類于同一分枝上，可見這9個六堡茶樣品中優勢曲霉屬的種類較為單一。分離菌株的聚類結果及分離來源見表3。

圖4 基于β-tubulin基因序列構建的系統發育進化樹Figure 4 Phylogenetic tree based on the BenA gene

2.5 分離菌株的酶活

對分離自不同年份的六堡茶的真菌菌株進行不同種類酶活的檢測（表4），菌株CHA12的淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶以及酯酶酶活均較高，分別為2.59±0.15、1.16±0.06、1.17±0.04、1.6±0.02和1.47±0.02，與其他菌株相比5種酶活均具有差異顯著性，因此菌株CHA12為六堡茶的潛在功能菌株。

表4 分離菌株的酶活結果Table 4 The enzyme activities of five kinds of isolated strains

2.6 真菌的毒素

利用HPLC法檢測結果顯示，菌株CHA12的發酵液四種真菌毒素結果如表5所示，均低于檢出線，可見該菌株生物安全性較高。

表5 琉球曲霉CHA12發酵液的毒素檢測結果Table 5 Toxin detection results of A. luchuensis CHA12 fermentation broth

對9種茶葉樣品采用HPLC法對常見的四種真菌毒素進行檢測，結果顯示這9種茶葉樣品的檢測結果均為陰性未檢出，毒素檢測的標準樣品色譜圖以及部分樣品的檢測色譜圖見圖5及圖6。

圖5 樣品Y2018_60219的黃曲霉毒素檢測色譜圖Figure 5 Aflatoxin detection chromatogram of sample Y2018_60219

圖6 樣品Y2008的赭曲霉毒素A檢測色譜圖Figure 6 Ochratoxin A detection chromatogram of sample Y2008

3 討論

本試驗研究通過高通量測序揭示了取自梧州代表性茶廠的9個六堡茶樣品的真菌群落結構，通過分析發現六堡茶樣品中的優勢真菌主要為曲霉屬（Aspergillus）、芽生葡萄孢酵母屬（Blastobotrys）及節擔菌屬（Wallemia），共分析得到94個OUT，可以歸類為4個門、6個綱、6個目、8個科以及8個屬。分離20株優勢真菌同屬于曲霉屬，其中數量最多的為琉球曲霉，其次為塔賓曲霉。高通量測序結果與菌株分離結果相吻合，但是高通量測序結果顯示豐度較高的芽生葡萄孢酵母屬及節擔菌屬通過可培養方法并未分離到，可能是由于這些種屬的菌在陳放過程中逐漸消亡，僅以死菌的形式存在于茶葉中。

目前研究者們利用高通量測序技術對六堡茶中的真菌多樣性也進行了大量的研究，徐書澤[7]利用高通量測序技術對梧州茶廠的4個成品六堡茶的真菌多樣性和群落結構進行研究，共鑒定得到3個門、7個綱、9個目、6個科和8個屬的真菌類群，包括曲霉屬（Aspergillus）、散囊菌屬（Eurotium）、青霉屬（Penicillium）、Blastobotrys、Guehomyces、Rasamsonia、Rossbeevera和翹孢霉屬（Emericella），其中曲霉屬和散囊菌屬在這4個樣品中的相對豐度最高；同時通過傳統分離培養技術分離鑒定得到了曲霉屬中的8種微生物，包括黑曲霉、塔賓曲霉、煙曲霉、米曲霉、薩氏曲霉、赭曲霉、溜曲霉以及菌核曲霉。楊雅焯等[15]利用高通量測序的方法對比六堡茶和重慶沱茶的微生物多樣性區別，發現Blastobotrys是六堡茶的真菌優勢菌。

本試驗分離得到的優勢真菌為曲霉屬真菌，其中琉球曲霉在六堡茶中為首次報道，與已有報道的六堡茶發酵過程中優勢種為曲霉屬中的黑曲霉（A.niger）、塔賓曲霉（A. tubingensis）[7,16-17]、散囊菌屬中的冠突散囊菌（A.cristatus）、謝瓦氏散囊菌（A.cheralieri）[18-20]等的結果均不一致。該結果表明不同廠家的六堡茶其真菌種類各有特征且差異較大，推測差異主要源于生產環境以及原料中微生物種類及數量的不同。

六堡茶發酵過程中，微生物通過自身的代謝產生多種胞外酶，對淀粉、蛋白質、纖維素、果膠以及茶多酚等大分子物質進行分解，也產生多種香氣物質[21-22]，最終影響了六堡茶的品質。六堡茶特有色香味的形成，是蛋白質、茶多酚等物質在發酵過程中由于水分、溫度及有益微生物的綜合作用，發生水解、糖解和氧化聚合等物理和化學變化而形成的[23]，因此本研究還考察了分離自六堡茶的20株霉菌產胞外酶的能力，并從中選取了一株產淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶以及酯酶能力都較強的琉球曲霉，通過選育產酶性能優良的菌株，以期提升茶葉傳統發酵工藝。

六堡茶等黑茶的真菌毒素污染風險已經引起了廣泛的關注。本文還分析了9份茶葉樣品以及通過產酶特性篩選得到的菌株發酵液的產毒素情況，發現茶葉中常見的四種真菌毒素包括黃曲霉毒素（B1、B2、G1、G2）、赭曲霉毒素A、伏馬毒素以及桔青霉毒素均未檢出，且優勢菌琉球曲霉未見產毒素和致病性報道[24]。

本試驗研究通過對六堡茶真菌多樣性、多種酶活、產毒素情況進行分析，篩選獲得一株產酶性能優良且安全性好的琉球曲霉CHA 12，該菌株對中茶六堡茶工藝升級和品質穩定性提升具有重要意義，該菌株的應用可促進六堡茶產品升級和發酵茶產業發展。