ATP生物熒光法在乳品企業(yè)清洗效果評(píng)價(jià)方面的應(yīng)用

丘勒紅，梁俊健，林淑儀，林夏純，何 瑛，楊愛君

廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司，廣東廣州 510700

0 引言

牛奶中富含營養(yǎng)物質(zhì)，非常容易滋生細(xì)菌等微生物，而清洗可以去除生產(chǎn)線上的牛奶殘留，切斷微生物滋生所需的營養(yǎng)，同時(shí)減少生產(chǎn)線上的牛奶與微生物形成的生物膜或生物頑垢，讓后續(xù)的消毒無附著物的遮蔽，而且徹底的清洗是有效消毒的基礎(chǔ)[1]。因此，有效清洗是衛(wèi)生管控的重要措施之一，對(duì)清洗效果進(jìn)行驗(yàn)證則是衛(wèi)生管控的重要環(huán)節(jié)。

目前，乳品企業(yè)常用感官檢查法（如肉眼檢測、嗅覺檢查等）、傳統(tǒng)微生物檢測法和ATP生物熒光法進(jìn)行清洗效果驗(yàn)證。然而，感官檢查法需達(dá)到工作人員肉眼或嗅覺可辨別的限量，其結(jié)果不能量化，且主觀因素影響較大；傳統(tǒng)微生物檢測法耗時(shí)長，操作繁瑣，檢測結(jié)果滯后，而且反映的是“無菌”程度，而非“清洗”效果[2]。因此，判斷清洗效果不應(yīng)測量活體微生物的存在，而應(yīng)通過測量清洗后殘留的污染物數(shù)量來確定。ATP生物熒光法彌補(bǔ)了感官檢查法與傳統(tǒng)微生物檢測法的局限性，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、簡便、可靠等優(yōu)點(diǎn)，能在幾十秒內(nèi)獲得檢測結(jié)果，是目前清潔驗(yàn)證最有效的技術(shù)之一。

1 三磷酸腺苷（ATP）生物熒光法的基本原理

三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate，ATP）是含高能磷酸鍵的有機(jī)化合物，是生命過程的主要能量來源。在細(xì)菌、酵母菌和霉菌以及所有的動(dòng)物和植物體中，包括食物和食物殘?jiān)卸己蠥TP。ATP生物熒光法就是通過脫去1 個(gè)或多個(gè)磷酸基來釋放能量，熒光素獲得ATP釋放的能量后發(fā)光，ATP熒光檢測儀把光轉(zhuǎn)化成光電信號(hào)，產(chǎn)生讀數(shù)，檢測結(jié)果表示為相對(duì)光單位（RLU）[3]，和ATP的總量成正比，RLU數(shù)值越高，表明ATP的量越多，也意味著生物量殘留越多。

ATP水平和微生物數(shù)量有著密切的相關(guān)性，但不能直接將ATP熒光檢測儀測定的RLU數(shù)值和標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)相對(duì)比，因?yàn)锳TP數(shù)值所反映的生物殘留，不僅僅是微生物，還包括殘留污垢，而殘留的污垢是微生物生長的營養(yǎng)源，例如剛生產(chǎn)完滅菌乳而尚未清洗的生產(chǎn)設(shè)備，如果采用傳統(tǒng)微生物法進(jìn)行檢測，幾乎檢測不到活菌，但它的RLU數(shù)值卻會(huì)很高，因?yàn)闅埩粼谠O(shè)備上的滅菌乳也有ATP。

因此，ATP生物熒光法可以快速判定各個(gè)環(huán)節(jié)的清潔程度，從而達(dá)到衛(wèi)生控制的目的。

2 ATP清潔驗(yàn)證方案的建立、

乳品企業(yè)可通過“風(fēng)險(xiǎn)分析，確定采樣位點(diǎn)→標(biāo)準(zhǔn)化操作，采集參考數(shù)據(jù)→設(shè)定檢測限值→制定采樣計(jì)劃，實(shí)施監(jiān)測→檢出異常，分級(jí)管控→數(shù)據(jù)分析，持續(xù)改善”等方面建立清潔驗(yàn)證方案。

2.1 風(fēng)險(xiǎn)分析，確定ATP采樣位點(diǎn)

乳品企業(yè)應(yīng)根據(jù)工藝流程，識(shí)別出需要進(jìn)行清潔效果監(jiān)測的相應(yīng)設(shè)施設(shè)備，以鮮牛奶為例，涉及的設(shè)施設(shè)備包括奶槽車、收奶管、凈乳機(jī)、儲(chǔ)奶罐、殺菌機(jī)、灌裝機(jī)等，同時(shí)要對(duì)各設(shè)施設(shè)備的功能、特性、結(jié)構(gòu)、與產(chǎn)品接觸面等信息進(jìn)行評(píng)估，梳理出各設(shè)施設(shè)備的所有潛在采樣位點(diǎn)，如儲(chǔ)奶罐，潛在的采樣位點(diǎn)包括儲(chǔ)奶罐上蓋、儲(chǔ)奶罐內(nèi)壁、取樣口、攪拌葉、探針、排液口等。最后根據(jù)各潛在采樣位點(diǎn)對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量影響顯著程度以及清洗的難易程度建立風(fēng)險(xiǎn)矩陣（圖1）進(jìn)行分析，確定采樣位點(diǎn)。

圖1 風(fēng)險(xiǎn)矩陣圖

采樣位點(diǎn)應(yīng)選擇對(duì)最終產(chǎn)品質(zhì)量與衛(wèi)生影響顯著以及清洗難度大的地方，尤其要重點(diǎn)關(guān)注表面拋光不佳、焊接點(diǎn)、管道聯(lián)接處、密封墊圈、清潔死角等位置。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)化操作，采集參考數(shù)據(jù)

采樣位點(diǎn)確定以后，便可開始采集檢測數(shù)據(jù)，正確使用采樣棒是采集檢測數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)。常用的采樣棒有兩種：一種是表面采樣棒，專門用于檢測清潔后表面清潔程度的測試工具，可以直接對(duì)清潔后的設(shè)備、器械表面進(jìn)行涂抹采樣。另一種是水質(zhì)采樣棒，專門用于檢測難以用涂抹棒采樣的區(qū)域清潔后的沖洗水樣，如在位清洗（CIP）系統(tǒng)，無需拆卸部件，通過對(duì)沖洗水的檢測來指示相應(yīng)水中的生物含量。

2.2.1 表面采樣棒的使用

將涂抹棒從采樣管中抽出，用食指和拇指握住涂抹棒手柄，注意不要碰觸采樣頭。涂抹采樣時(shí)，使采樣棒與待測表面成30°夾角，用力輕壓采樣棒使采樣頭緊貼待測位點(diǎn)，水平、上下重復(fù)涂抹，直至涂抹完待測區(qū)域整個(gè)表面。涂抹完成后將采樣棒插回并完全按入采樣管中，充分混合試劑，激活A(yù)TP發(fā)光反應(yīng)，立即將采樣管放入檢測儀中進(jìn)行檢測[4]。

2.2.2 水質(zhì)ATP采樣棒的使用

用潔凈且無菌的容器采集水樣，將采樣棒從采樣管中旋轉(zhuǎn)取出，將采樣棒頭部完全浸入水樣內(nèi)，保持5 s進(jìn)行采樣。采樣完成后將采樣棒直立手持，重新旋轉(zhuǎn)插回并完全按入采樣管中，激活A(yù)TP發(fā)光反應(yīng)，2 min內(nèi)將采樣管放入檢測儀中進(jìn)行檢測[5]。

2.2.3 建立統(tǒng)一的操作標(biāo)準(zhǔn)SOP

ATP表面采樣棒的采樣面積一般為（10×10）cm2，然而并不是所有的檢測位點(diǎn)都適合該采樣面積，如出奶口、灌注管等檢測位點(diǎn)應(yīng)根據(jù)實(shí)際結(jié)構(gòu)和性狀，制定采樣面積[6]，采取相應(yīng)的有效涂抹手法，各位點(diǎn)涂抹手法可以不同，但同一位點(diǎn)每次涂抹時(shí)手法必須一致。因此，乳品企業(yè)應(yīng)建立統(tǒng)一的操作標(biāo)準(zhǔn)SOP（圖2），明確各采樣位點(diǎn)的具體采樣位置、采樣面積、采樣手法等，并做好相關(guān)人員的操作培訓(xùn)。

圖2 ATP采樣操作標(biāo)準(zhǔn)參考模板

一個(gè)檢測位點(diǎn)應(yīng)至少重復(fù)涂抹采樣5 次，對(duì)于檢測結(jié)果波動(dòng)較大的位點(diǎn)，則需要增加檢測數(shù)據(jù)量。每次采集參考數(shù)據(jù)時(shí)，應(yīng)對(duì)檢測位點(diǎn)“清洗前”“清洗后”和“深度清洗后”三方面的檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行采集。“清洗前”的檢測數(shù)據(jù)，即初步?jīng)_洗后，開始清潔前采集的檢測數(shù)據(jù)，反映清潔前的表面污染水平；“清洗后”的檢測數(shù)據(jù)，即完成清潔后，消毒殺菌之前采集的檢測數(shù)據(jù)，反映常規(guī)清潔后的表面清潔水平，檢測時(shí)應(yīng)確保無肉眼可見的污垢；“深度清洗后”的檢測數(shù)據(jù)，即比常規(guī)清潔更嚴(yán)格的方式處理后采集的檢測數(shù)據(jù)，反映可實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)水平[7]。

2.3 設(shè)定檢測限值

不同的檢測位點(diǎn)可能由于表面材質(zhì)、老化/損蝕程度、清洗方式等差異表現(xiàn)出不同的RLU水平。乳品企業(yè)可根據(jù)采集到的參考數(shù)據(jù)，通過與微生物檢驗(yàn)的比對(duì)，再結(jié)合自身的質(zhì)量安全控制要求和相應(yīng)的法律法規(guī)，設(shè)定相應(yīng)的限值，一般設(shè)置3 個(gè)水平：合格、警告、不合格（圖3）[8]。

圖3 設(shè)定檢測限值

2.4 制定采樣計(jì)劃，實(shí)施監(jiān)測

乳品企業(yè)應(yīng)根據(jù)各檢測位點(diǎn)的風(fēng)險(xiǎn)分析結(jié)果制定采樣監(jiān)測計(jì)劃，明確各檢測位點(diǎn)的風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)、采樣頻率、合格限值等，其中風(fēng)險(xiǎn)越高的檢測位點(diǎn)，采樣頻率越高。

2.5 檢出異常，分級(jí)管控

在實(shí)施清潔驗(yàn)證的過程中，如出現(xiàn)“警告”和“不合格”時(shí)，要根據(jù)該檢測位點(diǎn)風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)的高低，采取相應(yīng)的措施：①若出現(xiàn)“警告”，是低風(fēng)險(xiǎn)的檢測位點(diǎn)，可進(jìn)行生產(chǎn)，但同時(shí)要查出問題原因，下次清洗后再檢測；②若出現(xiàn)“警告”，是高風(fēng)險(xiǎn)的檢測位點(diǎn)，則不應(yīng)生產(chǎn)，須重新清洗，再次檢測；③若出現(xiàn)“不合格”，一律不許生產(chǎn)，須重新清洗后檢測合格方可生產(chǎn)。

不管是“警告”還是“不合格”，現(xiàn)場管理人員都應(yīng)予以重視，找出影響設(shè)備清洗質(zhì)量的因素，并將之糾正。

2.6 數(shù)據(jù)分析，持續(xù)改善

乳品企業(yè)可根據(jù)ATP檢測結(jié)果結(jié)合實(shí)際的生產(chǎn)情況調(diào)整清洗工藝，如采用一堿一酸、兩堿一酸（即前兩次采用熱堿清洗，第二次采用熱酸清洗）、選用復(fù)合清洗劑，甚至酶清洗技術(shù)[9]等。

此外，現(xiàn)在市面上大部分品牌的ATP檢測儀都配套有數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)，乳品企業(yè)可以通過連接檢測儀和電腦，把檢測儀里面的一個(gè)個(gè)檢測數(shù)據(jù)傳輸?shù)綌?shù)據(jù)管理系統(tǒng)當(dāng)中，對(duì)所有的數(shù)據(jù)進(jìn)行有效管理，將零散的數(shù)據(jù)整合為集成信息。管理人員通過系統(tǒng)可以查看每個(gè)檢測位點(diǎn)在一段時(shí)間內(nèi)的檢測情況，評(píng)估清洗效果的穩(wěn)定性、一致性和有效性等，分析出現(xiàn)不合格檢測結(jié)果的原因，精確查明導(dǎo)致污染的問題所在，分析設(shè)備、員工和生產(chǎn)過程的變化趨勢，預(yù)測可能發(fā)生的問題，當(dāng)觀察到趨勢向著不良結(jié)果發(fā)展時(shí)，應(yīng)快速識(shí)別現(xiàn)有的和可能發(fā)生問題的位點(diǎn)，立即采取措施進(jìn)行改善，優(yōu)化清洗工藝和資源分配。

3 討論

3.1 關(guān)于ATP檢測的溫度影響

生物熒光測定本質(zhì)上是一個(gè)酶促反應(yīng)，溫度對(duì)檢測結(jié)果也會(huì)產(chǎn)生影響，一般體現(xiàn)在兩個(gè)方面：一方面是溫度可直接影響樣品的活性狀態(tài)，在低溫狀況下，細(xì)菌生物活性降低，體內(nèi)ATP濃度也明顯降低。另一方面熒光素酶活性受溫度影響明顯，溫度越高，酶促反應(yīng)越快[10]。樊廣華[11]等的研究表明，熒光素酶反應(yīng)的最佳溫度是23～25 ℃。然而涂抹棒可低溫存放也可室溫存放，如果采用低溫存放的，測試前應(yīng)提前取出，待回升至室溫再進(jìn)行檢測。如果是采集水樣進(jìn)行ATP檢測，應(yīng)確保水樣溫度不超過30 ℃。

3.2 關(guān)于ATP檢測限值的設(shè)定

由于表面材質(zhì)的不同、老化/損蝕程度的差異，甚至不同品牌的ATP檢測設(shè)備都會(huì)造成檢測結(jié)果的差異。目前，對(duì)于檢測限值沒有統(tǒng)一的判斷標(biāo)準(zhǔn)，大部分乳品企業(yè)都是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)制定本企業(yè)的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

3.3 關(guān)于數(shù)據(jù)的趨勢分析

ATP檢測不僅僅只是判定清潔情況的合格與否，它更可以通過數(shù)據(jù)分析預(yù)測趨勢發(fā)展，（圖4），雖然所有的檢測結(jié)果都在合格范圍內(nèi)，但是不難看出其有一個(gè)向著不合格發(fā)展的趨勢，此時(shí)就應(yīng)該調(diào)查原因，找出問題，采取糾正措施。

圖4 ATP檢測數(shù)據(jù)趨勢圖

4 總結(jié)

ATP生物熒光法的精確測量可以指導(dǎo)及時(shí)的清洗評(píng)估和長期的管理決策，通過有效地收集檢測數(shù)據(jù)并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合及分析，發(fā)現(xiàn)隱藏的風(fēng)險(xiǎn)，及時(shí)提出應(yīng)對(duì)措施，進(jìn)行科學(xué)決策，為優(yōu)化清洗工藝、保證清洗效果提供專業(yè)依據(jù)。乳品企業(yè)應(yīng)根據(jù)自身實(shí)際情況建立清潔驗(yàn)證方案，在確保感官檢查合格的情況下，結(jié)合ATP生物熒光法監(jiān)測清潔效果，同時(shí)定期用微生物檢測法進(jìn)行驗(yàn)證。