變質原料乳中假單胞菌的分離鑒定及產蛋白酶特性研究

胡少震，李蓮瑞

1 塔里木大學生命科學與技術學院，新疆阿拉爾 843300

2 塔里木大學動物科學與技術學院，新疆阿拉爾 843300

3 塔里木畜牧科技兵團重點試驗室，新疆阿拉爾 843300

關鍵字：變質原料乳；假單胞菌；分離鑒定；蛋白酶活力

0 引言

原料乳是各種乳制品的基本原料，其質量是保證乳制品安全的關鍵因素[1]。原料乳中含有豐富的營養(yǎng)物質，是天然的微生物培養(yǎng)基，極適合微生物的生長繁殖[2]。隨著冷鏈技術在食品運輸中的廣泛應用，嗜熱鏈球菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等一些嗜溫、嗜熱微生物生長受到抑制，而具有嗜冷特性的細菌可以在低溫下繼續(xù)生長，成為原料乳中的優(yōu)勢菌[3]，該菌可通過在MPC瓊脂板上6.5 ℃培養(yǎng)10 d進行靶向分離。假單胞菌作為原料乳的主要污染嗜冷菌，80%的假單胞都攜帶aprX基因位點[4]，該基因可以表達胞外金屬蛋白酶，這些酶具有熱不敏感性，即使通過135 ℃ 1 min熱處理，酶殘留率仍超過20%以上[5]，這些殘留的蛋白酶會導致乳制品在貨架期出現(xiàn)乳樣變酸、乳清析出、蛋白聚集、脂肪上浮等不良現(xiàn)象，嚴重破壞乳品品質，造成巨大的經濟損失[6]。本研究通過對變質原料乳中嗜冷微生物分離鑒定，明確造成原料乳發(fā)生質量問題的關鍵微生物，并測定了其蛋白酶活力，對原料乳的變質機理提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和設備

1.1.1 試劑

異常原料乳樣品：出現(xiàn)蛋白水解、脂肪上浮、變酸等現(xiàn)象，用于污染菌株的分離鑒定，由廣東省恒遠市規(guī)模化牧場提供。

培養(yǎng)基：MPC瓊脂培養(yǎng)基，北京依珊匯通科技有限公司；LB液體培養(yǎng)基、脫脂乳瓊脂培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術有限責任公司。

試劑：蛋白胨鹽溶液，北京奧博星生物技術有限責任公司；細菌基因組提取試劑盒、Lysozyme （50 mg/mL）、Trans2K? Plus II DNA Marker、2x Taq PCR Master Mix，天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖、GeneGreen核酸染料，金連寶生物技術（北京）有限公司；PBS 緩沖液（50 mmol/L）、溴酚藍、β-巰基乙醇、2x Laemmli Sample Buffer、甲醇、冰醋酸、考馬斯亮藍有R-250，北京廣達恒益科技有限公司；偶氮酪蛋白，上海源葉生物科技有限公司；SurePAGE， Bis-Tris， 10%， 10 wells、Tris-MOPS-SDS Running Buffer Powder，南京金斯瑞生物科技有限公司。

偶氮酪蛋白（15 g/L）：取0.15 g偶氮酪蛋白用10 mL無菌水定容。

考馬斯亮藍溶液：稱取0.125 g考馬斯亮藍R-250溶于dd H2O中，加入30 mL甲醇，10 mL冰醋酸，最后加ddH2O定容至100 mL。

脫色液：甲醇30 mL，冰乙酸10 mL，加dd H2O至100 mL。

1.1.2 設備

超凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海恒科技有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；水浴鍋，寧波新芝科技有限公司；ABI 9700 PCR儀，ThermoFisher公司；高速臺式冷凍離心機，北京維根技術有限公司；TACAN全波長酶標儀，帝肯（上海）貿易有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料乳中蛋白質的水解測定

通過SDS-PAGE凝膠電泳對原料乳中蛋白質水解進行測定[7]，具體方法如下：

樣品準備：（1）a液：原料乳與去離子水按照1∶15混合為樣品處理液（a液）。（2）b液：溴酚藍與β-巰基乙醇按照1∶1混合。（3）c液：b液與2x Laemmli Sample Buffer 按照1∶1混合。（4） d液：c液與樣品處理液（a液）各取20 μL混合。（5）將上述d液于水浴鍋中100 ℃加熱5 min，備用。

電泳：將加熱處理后的d液用移液槍吸取10 μL在SurePAGE， Bis-Tris，10%，10 wells中進行點樣，點樣后放置在Tris-MOPS-SDS Running Buffer Powder中110 V電泳30 min。

染色，洗脫：使用Coomassie亮藍溶液對凝膠進行染色1 h，脫色液過夜脫色。

1.2.2 原料乳中假單胞的分離純化鑒定

樣品處理：為保證平板上長出單一菌落，將變質原料乳按10倍梯度連續(xù)稀釋3 次，將稀釋后樣品均勻涂布在MPC瓊脂板培養(yǎng)基上，6.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d。

分離純化：將大小形態(tài)不一樣的單菌落于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)48 h，連續(xù)培養(yǎng)兩代，對分離的細菌進行制片，革蘭氏染色，觀察其形態(tài)。此外，把生長為對數(shù)期的菌株用25%（v/v）的甘油保存至-20 ℃冰箱。

DNA提取：按照細菌基因組提取試劑盒說明書提取培養(yǎng)細菌的DNA，放置-20 ℃冰箱保存。

P C R擴增：利用上述提取的基因組作為模板，1 6 S r D N A通用引物（2 7 F：5' - AGAGTTGATCCTGGCTCAG - 3' 和 1492R： 5' - CGGTACCTTGTTACGACTT - 3'）進行細菌16S rDNA全長的擴增。擴增體系和條件如表1、圖1所示，擴增產物送至北京六合華大基因科技有限公司測序。

圖1 PCR擴增條件

表1 PCR擴增體系

序列比對：將測序序列進行拼接，完整的16S rDNA序列在NCBI上進行核苷酸序列比對，確定該菌的種屬。

1.2.3 蛋白酶活力檢測

本試驗分別采用10%的脫脂奶粉平板對菌液中蛋白酶進行可視化檢測，偶氮酪蛋白法對菌液中蛋白酶活力進行定性檢測[8]。

蛋白酶的可視化檢測：（1）菌株的活化：將甘油保存的菌株接種至LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h，傳代兩次。（2）脫脂乳平板的配置：稱取10 g脫脂奶粉，1.5 g瓊脂粉于錐形瓶中加去離子水至100 mL，115 ℃滅菌10 min，倒平板備用。（3）菌液的接種：滅菌的牛津杯放置平板中，吸取200 μL菌液接種牛津杯中，將平板放入28 ℃培養(yǎng)箱中24 h，觀察其水解圈。

蛋白酶殘留率測定：（1）將活化后菌液經135 ℃加熱5 s，熱處理后立即冰浴，用于蛋白酶耐熱性研究，對照組為未熱處理的菌液。（2）各取100 μL熱處理菌液和未處理菌液于2 mL無菌離心管中。（3）分別加入500 μL PBS 緩沖液（50 mmol/L），100 μL偶氮酪蛋白溶液（15 g/L）振蕩混勻，37 ℃反應60 min。（4）加入500 μL TCA（0.2 g/mL）室溫下靜置 30 min終止反應后。（5）將終止反應液于10 000 r/min、4 ℃條件下離心5 min。（6）取100 μL上清至96孔板中，對照組采用100 μL無菌 PBS代替上清液，在366 nm下將96孔板于酶標儀中測定吸光值。

蛋白酶耐熱性以酶活殘余率表示，酶活殘余率（RA）按照下述公式進行計算：

其中，RA：酶活殘余率（%）；HA：熱處理后蛋白酶活力（ΔΑ/h·mL）；IA：未處理初始蛋白酶活力（ΔΑ/h·mL）；蛋白酶活以每毫升的粗酶液每小時吸光度的增加值表示（ΔΑ/h·mL）。

2 結果與分析

2.1 變質原料乳中蛋白質的水解測定

通過SDS-PAGE凝膠電泳對變質原料乳中的蛋白進行表征，結果如圖2所示。其中，變質原料乳的乳鐵蛋白、血清白蛋白無電泳條帶，κ-酪蛋白電泳條帶極其淺，ɑ-酪蛋白、β-酪蛋白、β-乳白蛋白、ɑ-乳白蛋白有較清晰的電泳條帶。結果表明乳鐵蛋白、血清白蛋白已經完全被水解，K-酪蛋白、β-乳白蛋白、ɑ-乳白蛋白有部分被水解，說明原料乳中微生物產生的蛋白酶較復雜，含有多個蛋白的識別位點，可將多種蛋白質水解成多種氨基酸小分子物質[9]。

圖2 原料乳蛋白質水解圖

2.2 分離、純化、染色結果

將原料乳進行梯度稀釋后，6.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，結果如圖3所示。菌落比較單一，菌落形態(tài)為白色、表面光滑、隆起、有光澤、不透明。挑取兩株菌（S1、S2）28 ℃培養(yǎng)24 h，傳代兩次革蘭氏染色如圖4，該菌株為革蘭氏陰性菌、形狀為短桿狀。

圖3 菌落形態(tài)

圖4 革蘭氏染色結果

2.3 分離純化的菌株16S rDNA 擴增結果

提取分離菌株的DNA，用細菌通用引物16S rDNA對其擴增，PCR產物1%瓊脂糖凝膠電泳結果見圖5。該菌的16S rDNA 基因大小約為1 500 bp，與預期大小相符，送至北京六合華大基因科技有限公司測序。

圖5 電泳結果

2.4 分離菌株的鑒定結果

將測序序列在NCBI上進行核苷酸序列比對，判定分離菌株的物種，比對結果見表2，兩株分離菌株均為霍氏假單胞菌。通過對提交的序列進行進化樹的繪制，如圖6所示。該菌株與登陸號為NR_024911.1霍氏假單胞菌序列相似度為100%，可以確定這兩株分離菌株為霍氏假單胞菌。

表2 兩株菌BLAST結果

圖6 分離菌株的進化樹

2.5 蛋白酶活力檢測結果

圖7為霍氏假單胞菌的可視化鑒定結果，該菌株的水解圈為（15.35±0.56）mm。通過135 ℃加熱5 s后，蛋白酶殘留率為43.63%，說明該菌產生的蛋白酶即使經過高溫鈍化仍保持較高的酶活力，它的存在會水解乳中的蛋白質，造成一定的質量問題，因此應該加大對該菌的防控。

圖7 蛋白酶對脫脂乳的水解圈

3 討論

隨著冷鏈技術在食品領域的廣泛應用，嗜溫微生物生長受到抑制。嗜冷菌在長期進化中通過膜蛋白的磷酸化、去磷酸化等體內的一切復雜代謝反應完成對溫度的感知，減少冷休克蛋白生產，防止非必要的蛋白生成，可以在低溫下生長，成為原料乳的優(yōu)勢菌[10]。目前，已有人從低溫冷藏的原料乳中鑒定出隸屬于61 個屬169 個種的分離株，其中假單胞菌為主要的嗜冷菌[11]。它可以分泌一些胞外蛋白酶，這些酶具有熱不敏感性，即使通過高溫處理仍有較高的酶殘留率，會對長期保存的乳及乳制品持續(xù)破壞，出現(xiàn)凝膠、沉淀、苦味或酸味等現(xiàn)象[12]。

原料乳隨著保存時間的延長，假單胞菌的豐度不斷升高。大多數(shù)假單胞菌的存在會產生水解原料乳的蛋白酶，且該菌株的總數(shù)和蛋白酶活力呈現(xiàn)正相關[13]。徐煜等[14]對原料乳中嗜冷菌進行分離鑒定及蛋白酶活力檢測，結果顯示，在分離到的假單胞菌中，66.67%（36/54）假單胞菌都能產生胞外蛋白酶，并且所產的蛋白酶都有一定的耐熱能力，將分離鑒定的假單胞菌按照濃度為103CFU/mL接種到脫脂奶中，6 ℃培養(yǎng)5 d就能使脫脂乳溶液產生沉淀。本試驗結果與前人相似，變質原料乳中分離到的微生物為霍氏假單胞菌，并且該菌有較強的蛋白水解能力。因此，原料乳變質的原因可能是該菌產生的胞外蛋白酶分解乳中的蛋白質，從而使原料乳出現(xiàn)蛋白水解現(xiàn)象。牧場應加大對假單胞菌的防范措施。

4 結論

本試驗通過對變質原料乳中的微生物進行分離、純化、鑒定，發(fā)現(xiàn)可能引發(fā)原料乳變質的細菌為霍氏假單胞菌，并且該菌有較強的蛋白水解能力。