黃連根腐病病原菌的分離鑒定及其拮抗菌篩選

廖海浪 鐘芙蓉 柯汶佳 李娜 馬云桐,*

(1 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 611137；2 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物育種栽培研究所，成都 611300；3 西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611137)

黃連(COPTIDIS RHIZOMA，Huanglian)為毛茛科植物黃連Coptis chinensisFranch.、三角葉黃連C.deltoideaC.Y.Cheng et Hsiao或云連C.teetaWall.的干燥根莖，具有清熱燥濕，瀉火解毒等功效[1]。由于市場(chǎng)需求量大，野生資源被過(guò)度采挖，野生黃連原植物已處于瀕危的狀態(tài)。商品藥材主要來(lái)源于毛茛科植物黃連的栽培品。目前，生產(chǎn)中出現(xiàn)兩大急需解決的問(wèn)題，一是根腐病的防治；二是“連作障礙”的問(wèn)題。黃連連作也多導(dǎo)致根腐病暴發(fā)，黃連大面積腐爛死亡。根腐病多發(fā)生在黃連種植2～4年后，且不易被發(fā)現(xiàn)，一旦發(fā)生將造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。生產(chǎn)上常采用拔除病株，高錳酸鉀溶液灌根等方法處理，但效果不佳，缺乏有效的防治藥物。目前黃連根腐病的研究主要集中于病原菌分離鑒定等方面，但根腐病作為一種典型的土傳病害，通常可以分離獲得多種病原菌[2]，目前文獻(xiàn)報(bào)道的黃連根腐病的主要病原菌包括F.solani[3]、F.carminascens[4]、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)[5]、三線鐮刀菌(F.tricinctum)[5]、F.aνenaceum[6]和Diaporthe eres[7]。課題組前期研究表明黃連根腐病可能是由多種病原菌導(dǎo)致的，其中主要包括Fusarium、Volutella、Exophiala、Cylindrocarpon等多種真菌[8]。明確黃連根腐病病原菌，是認(rèn)識(shí)和解決黃連根腐病的第一步。本研究采用經(jīng)典的柯赫氏法則進(jìn)行黃連根腐病病原菌分離和致病性測(cè)定，通過(guò)分子和形態(tài)對(duì)其進(jìn)行鑒定，并對(duì)其致病過(guò)程進(jìn)行研究，為黃連根腐病發(fā)生的微生態(tài)機(jī)制驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)，也為黃連根腐病的防治奠定一定基礎(chǔ)。

植物微生物組作為植物的擴(kuò)展基因組，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。越來(lái)越多的證據(jù)表明，宿主積極塑造自己的微生物群來(lái)抑制疾病發(fā)生[9]，微生物群在植物健康生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生積極影響。通過(guò)健康黃連根際根內(nèi)微生物網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，健康黃連根際根內(nèi)有大量的微生物與病原微生物呈負(fù)相關(guān)，表明健康黃連根際根內(nèi)存在大量的有益微生物，對(duì)病原微生物具有一定的拮抗作用，對(duì)于維持黃連植株的健康具有至關(guān)重要的作用[8]。本研究通過(guò)多種篩選培養(yǎng)基，對(duì)黃連根際根內(nèi)微生物進(jìn)行分離，采用平板拮抗實(shí)驗(yàn)篩選具有拮抗作用的微生物，為開發(fā)黃連根腐病的生物防治制劑奠定基礎(chǔ)，也為黃連根腐病微生物防治提供微生物資源。

1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2018年11 月于洪雅縣瓦屋山藥業(yè)有限公司黃連種植基地(四川省眉山市洪雅縣高廟鎮(zhèn)黑山村2組，29°29′10.91″ N，103°9′39.9″ E)采集健康黃連和感染根腐病黃連的帶土根系作為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 培養(yǎng)基

病原菌分離培養(yǎng)基選擇常用的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato glucose agar medium，PDA)，拮抗菌的分離選擇常用的真菌培養(yǎng)基包括PDA，察氏培養(yǎng)基(Czapek-Dox medium，CZ)，馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基(Martin's agar medium，M)和細(xì)菌培養(yǎng)基常用培養(yǎng)基包括土壤浸出液瓊脂培養(yǎng)基(soil extract agar medium，TR)[10]，酵母提取物甘露醇培養(yǎng)基(yeast extract mannitol medium，YEM)，M408培養(yǎng)基(M408)，自來(lái)水酵母提取物培養(yǎng)基(tap water yeast extract medium，TWYE)，酵母培養(yǎng)基(yeast medium，JM)。部分細(xì)菌培養(yǎng)基配方來(lái)源于16S rDNA數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)培養(yǎng)基(https://komodo.modelseed.org/growrec.htm)，主要培養(yǎng)基包括營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(nutrient agar medium，NA，ID：DSMZ_Medium1)，肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(Luria-Bertani medium，LB，DSMZ_Medium381)，內(nèi)生固氮菌培養(yǎng)基(diazotrophic medium，RBA，ID：DSMZ_medium441)，非自養(yǎng)培養(yǎng)基H3P(heterotrophic medium H3P，H3P，ID：DSMZ_Medium428)，胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(trypticase soy broth agar，535，ID：DSMZ_Medium535)，R2A培養(yǎng)基(R2A medium，830，ID：DSMZ_Medium830)，鏈霉菌培養(yǎng)基GYM(GYM Streptomyces medium，GYM，ID：DSMZ_Medium65)，胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基CASO(CASO agar，CASO，ID：DSMZ_Medium220)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 病原菌分離

采用組織分離法[53]，取感病黃連植株根莖及須根，自來(lái)水下沖洗干凈，75%乙醇消毒30 s，2%次氯酸鈉消毒10 min，無(wú)菌水漂洗3～5次，用濾紙吸干，用無(wú)菌剪刀剪取病健交界處，在無(wú)菌條件下接種于含青霉素100 mg/L的PDA培養(yǎng)基中，溫度設(shè)置為25℃，在培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)5～7 d。每天早晚各觀察1次，待有新的肉眼可見的菌落，立即采用劃線稀釋法進(jìn)行純培養(yǎng)，將純培養(yǎng)菌落接種于PDA斜面培養(yǎng)基，編號(hào)并記錄，25℃長(zhǎng)至菌落布滿整個(gè)培養(yǎng)基，于4℃保存菌種。

2.2 病原菌鑒定

2.2.1 病原菌系統(tǒng)發(fā)育分析

在PDA培養(yǎng)基上分別活化4℃冰箱中的保存的疑似病原菌，在25℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)5～7 d，取適量孢子或菌絲至2 mL的EP試管中，再用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒進(jìn)行DNA提取，按照試劑盒說(shuō)明書操作。

選用通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGC GG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')對(duì)ITS 序列進(jìn)行擴(kuò)增，通用引物EF-1(5'-CATCGAGAAGTT CGAGAAGGTT-3')和EF-2(5'-CATGTTCTTGATGAA -3')對(duì)EF-1α基因[11]進(jìn)行擴(kuò)增。

25 μL PCR反應(yīng)體系為：2×TaqPCR Master Mix溶液、10 μmol/L上下游引物各1 μL、模板2 μL，補(bǔ)充ddH2O至25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min； 94℃變性30 s，ITS 52℃退火30 s，EF-1α 56℃退火30 s，72℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán)；72℃總延伸7 min，4℃保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳監(jiān)測(cè)，將PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物送樣至擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。所得到的核苷酸序列在GenBank進(jìn)行同源性比較。用系統(tǒng)發(fā)育分析軟件PAUP* 4.0 Beta 10運(yùn)行相關(guān)文件，執(zhí)行最大簡(jiǎn)約法的分析運(yùn)算[12]。

2.2.2 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

將純化后的菌株接種于PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，25℃倒置培養(yǎng)，觀察菌落特征。使用插片培養(yǎng)法對(duì)病原菌的形態(tài)進(jìn)行鑒定，即將無(wú)菌的蓋玻片以45°斜插入培養(yǎng)基中，緊靠接種物，使菌體沿蓋玻片生長(zhǎng)，置25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d。培養(yǎng)完畢后，取出蓋玻片放在載玻片上，直接用低倍鏡觀察病原真菌的自然生長(zhǎng)個(gè)體形態(tài)。觀察記錄解剖鏡下菌落特征、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及孢子形態(tài)。

2.2.3 病原菌致病性測(cè)定

隨機(jī)選取2年生黃連，每組10株，自來(lái)水下沖干凈，錫箔紙包裹地上部分，無(wú)菌操作臺(tái)上對(duì)根部進(jìn)行滅菌，依次用75%乙醇消毒30 s，2%次氯酸鈉消毒10 min，無(wú)菌水漂洗3～5次，用濾紙吸干表面水分。分別在濃度為106CFU/mL的各種真菌孢子混懸液中浸根30 min，另外在0.5%吐溫20磷酸緩沖液中浸根相同時(shí)間作為空白對(duì)照，單株放置于50 mL無(wú)菌離心管中，管口用無(wú)菌的濕棉花保持根部濕潤(rùn)，離心管用錫箔紙包裹遮光，置于人工氣候室培養(yǎng)7～10 d，觀察并記錄各組幼苗生長(zhǎng)變化情況。待黃連發(fā)病后，從接種發(fā)病的黃連須根上再次分離病原菌，完成柯赫氏法則驗(yàn)證，則能確認(rèn)為黃連根腐病原菌。

2.3 病原菌侵染過(guò)程觀察

取健康黃連根系，洗凈，自來(lái)水下沖洗1 h，按照無(wú)菌操作法，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌瓶中，75%乙醇浸泡30 s，2%次氯酸鈉溶液消毒10 min，無(wú)菌水清洗5次，每次1 min。分別置墊有濾紙保濕的容器中，每個(gè)容器置3個(gè)樣品。用移液槍取上述孢子懸浮液分別滴加在不同的樣品上，以滴加0.5%吐溫20磷酸緩沖液和1%綠豆湯培養(yǎng)基的樣品為空白對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)3次，將容器置于25℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。分別于接種后0.5、1、2、3、4、5、6 和7 d隨機(jī)選取3根黃連根系用于固定。用手術(shù)解剖刀將黃連根系樣本切成0.5～ 1 cm長(zhǎng)的小段，將樣品置入pH6.8、2.5%戊二醛固定液中，進(jìn)行前固定并存放于4℃冰箱中冷藏2 h左右。將固定液吸出，使用pH6.8、0.1mol/L PBS緩沖液沖洗樣品3次，每次10 min。使用乙醇(其濃度為50%、70%和90%)進(jìn)行梯度濃度脫水，10 min/次，再用濃度為100%的乙醇脫水，15 min/次，重復(fù)2次。加入50 % 叔丁醇的乙醇溶液置換1次，再用純叔丁醇置換2次，每次15 min。將樣品取出黏附于導(dǎo)電碳膠帶上，置超臨界CO2干燥儀中進(jìn)行干燥。用Gressington 108型自動(dòng)濺射鍍膜機(jī)在樣品表面鍍上一層厚10.0～15.0 nm的金屬膜，置于SEM電鏡下觀察。

2.4 黃連根際根內(nèi)微生物分離

2.4.1 接種菌懸液制備

將黃連根系自土塊中取出，輕輕抖動(dòng)除去松散的附在根上的土粒。稱取約l0 g根系，置盛l00 mL無(wú)菌磷酸緩沖液(PBS)的三角瓶中，振蕩15 min，以洗下的土制成根際土懸液，離心得根際土。用無(wú)菌鑷子取出根系，用無(wú)菌濾紙吸干，用75%乙醇浸泡30 s，2%次氯酸鈉溶液消毒10 min，無(wú)菌水漂洗3～5次，取出后用無(wú)菌濾紙吸干，再用無(wú)菌剪刀將根剪成小段，即得黃連無(wú)菌根系。分別稱取根際土和無(wú)菌根系約1.0 g于無(wú)菌研缽中磨碎，然后加10 mL無(wú)菌磷酸緩沖液(PBS，Na2HPO41.44 g，KH2PO40.24 g，KCl 0.2 g，NaCl 8.00 g，溶解后定容至1 L，調(diào)pH至7.4，121℃滅菌15 min)攪拌混勻即得根內(nèi)菌懸液。以10倍稀釋法分別稀釋成一系列的稀釋液(10-2～10-8)。

2.4.2 黃連根際微生物分離

稀釋涂布法：取上述不同稀釋濃度的根際土菌懸液100 μL分別接種于上述培養(yǎng)基表面，用無(wú)菌涂布器涂布均勻。每個(gè)培養(yǎng)基，每個(gè)稀釋濃度各重復(fù)10次。培養(yǎng)條件，菌株純化保存同上。

2.4.3 黃連根內(nèi)微生物分離

外植體接種法：將滅菌的黃連根系小段，接種于平板培養(yǎng)基上，細(xì)菌采用37℃培養(yǎng)，真菌采用25℃培養(yǎng)。待有新的菌落長(zhǎng)成之后，挑取菌落到相應(yīng)培養(yǎng)基平板上經(jīng)過(guò)劃線稀釋法獲得單一菌落，挑取單一菌落至斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)并短時(shí)間保存。

稀釋涂布法：取上述不同稀釋濃度的根內(nèi)菌懸液100 μL分別接種于上述培養(yǎng)基表面，用無(wú)菌涂布器涂布均勻。每個(gè)培養(yǎng)基，每個(gè)稀釋濃度各重復(fù)10次。培養(yǎng)條件，菌株純化保存同上。

2.5 黃連根腐病生防菌篩選

2.5.1 生防細(xì)菌篩選

參照Hussein等[13]的平板對(duì)峙法，將黃連根腐病病原菌在PDA培養(yǎng)基平板上活化4 d，待長(zhǎng)出菌絲后，打孔器打孔菌餅(直徑7 mm)置于另一新鮮PDA培養(yǎng)基平板中央，將分離得到的細(xì)菌以劃線的方式接種于病原菌菌塊東南西北4個(gè)方向各1株待篩細(xì)菌，距離2.5 cm，菌株劃線長(zhǎng)度約2 cm，28℃培養(yǎng)3 d后，觀察病原菌與拮抗細(xì)菌之間是否有拮抗現(xiàn)象(明顯的拮抗帶或明顯的生態(tài)位占領(lǐng))，每組設(shè)3個(gè)平行。在對(duì)照組PDA平板中間接種病原菌瓊脂塊，28℃培養(yǎng)4 d，病原菌鋪滿整個(gè)平板[14]。采用兩側(cè)劃線同一拮抗細(xì)菌進(jìn)行復(fù)篩，培養(yǎng)7 d后測(cè)量拮抗半徑并計(jì)算抑菌率[15]。

2.5.2 生防真菌篩選

采用平板對(duì)峙法并略作修改，將黃連根腐病病原菌和待篩選真菌在PDA培養(yǎng)基平板上活化4 d，待長(zhǎng)出菌絲后，打孔器打孔菌餅置于另一新鮮PDA培養(yǎng)基平板中央，25℃下繼續(xù)培養(yǎng)2 d。將分離出的待選拮抗菌株點(diǎn)種于病原菌菌餅周圍，每皿接種4個(gè)點(diǎn)，4個(gè)點(diǎn)接種不同待篩真菌，25℃恒溫條件下培養(yǎng)，根據(jù)有無(wú)抑菌圈及抑菌帶的大小判斷其拮抗效果。同時(shí)對(duì)具有拮抗作用的菌株進(jìn)行二次對(duì)峙實(shí)驗(yàn)，篩選出拮抗能力較強(qiáng)的菌株以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)[16]。采用3點(diǎn)杯碟平板對(duì)峙生長(zhǎng)速率法，培養(yǎng)7 d后測(cè)量拮抗半徑并計(jì)算抑菌率[15]。

2.6 拮抗菌分子鑒定

4℃保存的拮抗細(xì)菌先于NA培養(yǎng)基上分別活化，細(xì)菌在37℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)5～7 d，細(xì)菌在25℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)5～7 d，取適量菌體至2 mL的EP試管中，再用細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒進(jìn)行DNA提取，按照試劑盒說(shuō)明書操作。

選用通用引物：27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3')和1429R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')對(duì)16S序列進(jìn)行擴(kuò)增。

選用通用引物：ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTG CGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')對(duì)ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增。

25 μL PCR反應(yīng)體系為：2 ×TaqPCR Master Mix溶液、10 μmol/L上下游引物各1 μL、模板2 μL，補(bǔ)充ddH2O至25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸90 s，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳監(jiān)測(cè)，將PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物送樣至擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

所得到的核苷酸序列在GenBank進(jìn)行同源性比較。選取標(biāo)準(zhǔn)菌株和原序列一起，采用在線的MAFFT(https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/index.html)進(jìn)行多序列比對(duì)[17]。采用Mesquite[18]將獲得的fasta格式序列轉(zhuǎn)換為phy格式。進(jìn)入ATGC網(wǎng)站(http://www.atgc-montpellier.fr/)，選擇在線工具PhyML進(jìn)行最大似然發(fā)育樹構(gòu)建[19]。

2.7 離體根上4株芽胞桿菌與2種病原菌的拮抗情況

以無(wú)菌水作為陰性對(duì)照(CK)，用鑒定出的4株芽胞桿菌屬細(xì)菌：B.νelezensisGJ-JM-1、B.subtilisGJTR-064、B.mycoidesGJ-LB-021、B.pseudomycoidesGJ-YEM-005。測(cè)定離體根的拮抗能力。選取約10 cm長(zhǎng)的須根，將病原體的孢子懸浮液(2.1×107CFU/mL，100 μL)接種在最右側(cè)(頂端)10 mm的須根內(nèi)，將相應(yīng)的芽胞桿菌菌株(A600=1、100 μL)接種在最左側(cè)(基部)10 mm的須根內(nèi)。濕潤(rùn)培養(yǎng)7 d后，觀察離體根病原菌侵染的距離和侵染率。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 病原菌分離鑒定

3.1.1 病原菌系統(tǒng)發(fā)育分析

通過(guò)病原菌分離，共獲得12株疑似病原菌，經(jīng)過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST比對(duì)，挑選合適菌株，基于供試菌株的ITS、EF-1α基因序列構(gòu)建聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖1所示，供試菌株CC-2-1，CC-2-2，CC-2-3，CC-2-4，CC-JING-1，CC-JING-2，CC-5-1和CC-5-2與菌株F.solaniMAFF 840046和F.solaniTH03-1聚集于一支，且支持率達(dá)100%，供試菌株CC-4-1，CC-4-2，CC-4-3和CD-4-1與F.aνenaceumRIFA-7和F.aνenaceumCC32聚集于一支，且支持率達(dá)100%。

圖1 基于ITS和EF-1α串聯(lián)序列的進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on ITS and EF-1α concatenated sequences

3.1.2 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

CC-2-1，CC-2-2，CC-2-3，CC-2-4，CCJING-1，CC-JING-2，CC-5-1和CC-5-2在PDA形成白色稀疏菌絲體，在瓊脂中不產(chǎn)生色素。分生孢子較寬，直而粗壯，有3～5個(gè)隔膜。頂端細(xì)胞鈍而圓，足細(xì)胞幾乎沒有切口，鑒定為F.solani。(圖2 A、C、E)CC-4-1，CC-4-2，CC-4-3和CD-4-1在PDA形成了豐富的白色菌絲體，并在瓊脂中產(chǎn)生玫瑰色素。大型分生孢子長(zhǎng)而細(xì)，直至稍彎曲，有1～3個(gè)隔膜，細(xì)胞頂端逐漸變細(xì)和彎曲，鑒定為F.aνenaceum(圖2B、

圖2 代表病原菌的形態(tài)鑒定Fig.2 Morphological identification of representative pathogens

D、F)。

3.1.3 致病性測(cè)定及病原菌致病過(guò)程

各株病原菌回接后，黃連植株均表現(xiàn)為須根變黑，腐爛，須根病健交界處出現(xiàn)大量白色菌絲，葉片出現(xiàn)明顯的枯萎現(xiàn)象。選取腐爛根系病健交界處進(jìn)行再次分離，仍然能100%分離得到所用菌株(圖3)。

圖3 代表菌株致病性與大田黃連根腐病癥狀Fig.3 Pathogenicity of representative strains and symptoms of root rot of Coptis chinensis in field

兩種黃連根腐病病原菌侵染黃連根系過(guò)程基本一致，病原菌孢子在0.5 d內(nèi)便可黏附于黃連根系表面(圖4A和E)，于0.5～1 d內(nèi)開始萌發(fā)，2 d后菌絲黏附于黃連根系并迅速生長(zhǎng)(圖4B和F)，尋找黃連根系受損部位入侵黃連根系內(nèi)部(圖4C和G)，6～7 d遍布整個(gè)黃連根系并產(chǎn)生大量的孢子(圖4D和H)。

圖4 F.solani和F.aνenaceum侵染黃連根系過(guò)程Fig.4 Root infection process of by F.solani and F.aνenaceum in C.chinensis

3.2 黃連根際根內(nèi)微生物分離

采用多種培養(yǎng)基對(duì)黃連根系微生物進(jìn)行分離，不同培養(yǎng)基收集到的菌株數(shù)目見表1。健康黃連根際共獲得358株細(xì)菌和69株真菌，根內(nèi)共獲得170株細(xì)菌和175株真菌。

表1 健康黃連根際、根內(nèi)微生物分離統(tǒng)計(jì)Tab.1 Isolation and statistics of microorganisms in rhizosphere and endosphere of healthy C.chinensis

3.3 拮抗菌活性評(píng)價(jià)及分子鑒定(表2～3和圖5～6)

圖5 拮抗細(xì)菌與病原菌的平板拮抗活性Fig.5 The antagonistic activities of four representative antagonistic bacteria and pathogens

對(duì)篩選到的具有拮抗活性的細(xì)菌和真菌分別進(jìn)行DNA提取、16S區(qū)域和ITS區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，所得到的核苷酸序列在GenBank進(jìn)行同源性比較。選取標(biāo)準(zhǔn)菌株和原序列一起，采用在線的MAFFT進(jìn)行多序列比對(duì)。采用Mesquite軟件將獲得的fasta格式序列轉(zhuǎn)換為phy格式。進(jìn)入ATGC網(wǎng)站選擇在線工具PhyML進(jìn)行最大似然發(fā)育樹構(gòu)建。拮抗細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹見圖7～8，拮抗真菌系統(tǒng)發(fā)育樹見圖9。拮抗菌拮抗活性及菌株匯總見表2，拮抗細(xì)菌匯總見表～3。本實(shí)驗(yàn)共獲得77株拮抗菌，其中拮抗細(xì)菌58株，分布于7屬15種，拮抗真菌19株，分布于4屬5種。

圖7 拮抗細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of antagonistic bacter

圖9 拮抗真菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.9 Phylogenetic tree of antagonistic fungi

表2 拮抗細(xì)菌匯總表Tab.2 Summary of antagonistic bacteria

3.4 離體根上4株芽胞桿菌與2種病原菌的拮抗情況

如圖10所示，在離體黃連根系上，4株芽胞桿菌屬細(xì)菌與2種病原菌均具有一定的拮抗活性。4株芽胞桿菌屬細(xì)菌能在一定程度上抑制2種病原菌在黃連離體根上的菌絲蔓延。

圖10 離體根上4株芽胞桿菌與2種病原菌的拮抗情況Fig.10 Antagonism of 4 Bacillus strains against 2 pathogens on in detached roots

4 討論

根據(jù)擴(kuò)增子分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)感病黃連根內(nèi)腐生型(saprotroph)真菌顯著高于健康黃連根內(nèi)，感病黃連根內(nèi)動(dòng)物病原菌(animal pathogen)、土壤腐生菌(soil saprotroph)、植物腐生菌(plant saprotroph)、木質(zhì)腐生菌(wood saprotroph)顯著高于健康植株根內(nèi)[8]。感病黃連植株根際植物病原菌(plant pathogen)顯著高于健康黃連植株根際，這些真菌可能是黃連根腐病主要病原菌。相關(guān)性分析和指示物種Indicator分析表明黃連根腐病可能是由多種病原菌導(dǎo)致的，其中主要包括Fusarium、Volutella、Exophiala和Cylindrocarpon[8]。但本研究?jī)H分離得到12株病原菌，均屬于鐮刀菌屬真菌，這可能與取樣和分離條件有關(guān)，需要進(jìn)一步的研究。

續(xù)表2

表3 拮抗真菌匯總表Tab.3 Summary of antagonistic fungi

圖6 拮抗真菌與病原菌的平板拮抗活性Fig.6 The antagonistic activities of four representative antagonistic fungi and pathogens

擴(kuò)增子測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)黃連根際根內(nèi)具有豐富多樣的微生物，微生物網(wǎng)絡(luò)分析表明，黃連根系存在的大量微生物與黃連根腐病病原菌鐮刀菌屬細(xì)菌具有拮抗作用。本實(shí)驗(yàn)采用多種培養(yǎng)基對(duì)黃連根際根內(nèi)微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)，最終獲得427株根際菌，345株根內(nèi)菌，其中包括358株根際細(xì)菌，170株根內(nèi)細(xì)菌，69株根際真菌，175株根內(nèi)真菌。經(jīng)過(guò)平板拮抗實(shí)驗(yàn)共獲得77株拮抗菌，其中拮抗細(xì)菌58株，拮抗真菌19株。細(xì)菌主要分布于芽胞桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌(Pseudomonas)和寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)等。真菌主要分布于蟲草菌屬(Cordyceps)、曲霉菌屬(Aspergillus)、毛殼菌屬(Chaetomium)、間座殼屬(Diaporthe)、木霉菌屬(Trichoderma)、青霉屬(Penicillium)和炭疽菌屬(Colletotrichum)。

圖8 拮抗細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹(芽胞桿菌屬)Fig.8 Phylogenetic tree of antagonistic bacteria(Bacillus Sp.)

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，芽胞桿菌屬細(xì)菌，包括多種從本草中分離得到的B.s u b t i l i s[20-21]、B.p s e u d o m y c o i d e s[22]、B.m y c o i d e s[23]、B.ν e l e z e n s i s[24-25]、B.w i e d m a n n i i[26]、B.thuringiensis[27-28]、B.toyonensis[29-30]、B.cereus[31]、B.aryabhattai[29,32-33]等細(xì)菌對(duì)多種植物病蟲害具有防治作用，對(duì)宿主還有一定的促生作用。氯仿假單胞菌(P.chlorographis)能產(chǎn)生廣譜的抗真菌因子(AFFs)，包括疏水化合物吩嗪-1-甲酰胺(PCN)、氰化氫、幾丁質(zhì)酶和蛋白酶，被用作番茄根腐病病原菌Fusarium oxysporumf.sp.radicis-lycopersici的生物防治劑[34]。增加假單胞菌的多樣性，通過(guò)加劇資源競(jìng)爭(zhēng)和對(duì)病原菌的干擾，能夠顯著提高假單胞菌對(duì)病原菌的抑制作用，降低宿主發(fā)病率[35]。S.rhizophila對(duì)植物病原性真菌例如黃萎病菌(Erticillium dahliae)，茄子根瘤菌(Rhizoctonia solani)，菌核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)和人致病性真菌白念珠菌(Candida albicans)具有拮抗活性[36]。

毛殼菌(Chaetomium)被報(bào)道為一種廣譜生物殺菌劑，用于防治枯萎病等植物病害[37]。C.globosum能夠產(chǎn)生chaetoviridins A和B，chaetoviridins A處理可抑制稻瘟病和小麥葉銹病的發(fā)生超過(guò)80%[38]。從馬鈴薯干腐病罹病薯塊上分離得到的Acrostalagmus luteo-albus對(duì)馬鈴薯塊沒有致病性，對(duì)硫色鐮刀菌(F.sulphureum)、草莓鮮殼孢(Zythia fragariae)、西瓜殼二孢(Ascochyta citrullina)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、茄鏈格孢(Alternaria solani)、嗜果刀孢(Clasterosporium carpophilum)及蕓薹生鏈格孢(A.brassicicola)有明顯的抑菌或溶菌作用[39]。A.νersicolor[40]、T.harzianum[41-42]具有一定的抗真菌活性，木霉菌屬(Trichoderma)[43]可以通過(guò)產(chǎn)生抗生素、調(diào)節(jié)茉莉酸/水楊酸(SA)相關(guān)的防御途徑和形成生物膜來(lái)保護(hù)植物。這些真菌可以作為黃連或者其他植物鐮刀菌病害防治的候選菌株。

但是A.fumigatus[44]被報(bào)道能不同程度地引起植物發(fā)生病變。而在本實(shí)驗(yàn)的平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)中表明A.fumigatus對(duì)F.solani和F.aνenaceum具有一定的抑制作用，本文推測(cè)可能是能源物質(zhì)和生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng)促使A.fumigatus對(duì)黃連根腐病致病菌產(chǎn)生一定的拮抗作用。以上拮抗菌篩選結(jié)果僅為初步定性和文獻(xiàn)推測(cè)結(jié)果，其拮抗機(jī)制和實(shí)際應(yīng)用有待進(jìn)一步研究。

在黃連根腐病拮抗初篩平板拮抗實(shí)驗(yàn)中，多種因素可能會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性，課題組選擇其中4株在離體根和平板上均具有較強(qiáng)拮抗活性的芽胞桿菌[BCA，B.νelezensisGJ-JM-1，B.subtilisGJTR-064，B.mycoidesGJ-LB-021，B.pseudomycoidesGJ-YEM-005]。于大田環(huán)境下，采用人工接種F.solaniCC-JING-1誘導(dǎo)黃連根腐病發(fā)生，提前7 d接種或接種Fs后在接種4株芽胞桿菌的混合菌液，評(píng)價(jià)BCA對(duì)黃連根腐病的預(yù)防和作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)BCA對(duì)黃連根腐病具有一定的防治作用。后期課題組將對(duì)4株芽胞桿菌對(duì)黃連根腐病的防治作用進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)價(jià)及應(yīng)用研究。