竹筍多糖復合酶法提取工藝及其抗氧化活性研究

周芷冉，劉曉翠，田 瑾

（西華大學食品與生物工程學院,四川 成都 610039）

竹子屬于古單子生落葉草本植物傘形綱禾本草亞目禾稈草本科，竹筍是竹子的幼體。我國食用竹筍的歷史悠久，竹筍是中國的傳統森林蔬菜[1]。竹筍營養十分豐富，不僅富含蛋白質、膳食纖維、維生素，還含有多種氨基酸和微量元素[2]，可以促進消化，治療“三高”，預防癌癥等[3]。

竹筍多糖是從竹筍中提取出的一類活性多糖，因為其具有提高人體免疫、抗氧化、防衰老、抗癌防腫瘤等多種生理活性使其具有很重要的保健食療功能[4]。多項研究表明，多種植物多糖均具有抗氧化作用[5]。竹筍多糖具有較強的羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除抑制能力和還原能力[6 -7]。

目前多糖常用的提取方法有酸堿提取法[8-9]、熱水浸提法[10]、超聲波提取法[11]和微波提取法[12]等。另外，也有使用單一生物酶輔助提取多糖的[13]。由于酶具有專一性且高效[14]，所以現如今使用酶法提取多糖十分熱門。該法條件溫和，能基本完整地保持多糖的分子結構，在提取工程中，環保無污染，有利于工廠規模化生產[15]，而且相較于其他方法，多糖得率也更高[16-17]。關于復合酶法提取竹筍多糖的研究起步晚，報道也比較少。為此，本研究采用單因素試驗和正交試驗優化復合酶法提取竹筍多糖的工藝條件，獲得最佳提取條件，并測定本實驗提取的竹筍多糖的抗氧化活性，以期為竹筍多糖的進一步開發利用和深入研究提供一些參考。

1 材料與設備

1.1 材料與試劑

竹筍，四川億達豐農業有限公司；90%乙醇、葡萄糖標準品、濃硫酸、果膠酶、苯酚、濾紙，成都市科隆化學品有限公司；纖維素酶、中性蛋白酶、DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼），上海源葉生物科技有限公司；維生素C，華中藥業股份有限公司。

1.2 儀器與設備

電子天平DSA224S，賽多利斯科學儀器公司；粉碎機、恒溫水浴鍋JHH-4，冠森生物科技有限公司；TD-5M 臺式低速離心機，四川蜀科儀器有限公司；精密鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；pH 計、抽濾機，鄭州長盛實驗儀器有限公司；SpectraMax?i3x 酶標儀，美谷分子儀器（上海）有限公司。

2 方法

2.1 原料預處理

取一定量竹筍經清洗、干燥、粉碎、過60 目篩后得到竹筍干粉，干燥處保存。

2.2 酶解法提取多糖

取5 份竹筍粉各1 g 于250 mL 錐形瓶中，按適當的料液比添加蒸餾水并混合均勻，調節pH，加入復合酶（纖維素酶∶果膠酶∶蛋白質酶=1∶1∶1），在設定溫度中水浴酶解，抽濾，用蒸餾水洗滌3 次，沸水浴處理15 min 以滅酶，接著離心5 min（3 500 r/min）。得到上層液后使用旋蒸濃縮儀濃縮至原液約四分之一體積后加入4 倍體積95%乙醇溶液4 ℃靜置24 h，再離心處理15 min（3 500 r/min）。真空干燥沉淀（40 ℃，12 h）后，得到竹筍多糖[18]。

2.3 竹筍多糖提取率測定

竹筍多糖提取率的測定使用苯酚-硫酸法[19]，葡萄糖標準曲線方程為y=6.828 6x-0.009，R2=0.999。

2.4 復合酶法提取竹筍多糖工藝條件確定

2.4.1 各單酶最佳添加量確定

2.4.1.1 單因素實驗

稱5 份竹筍粉各1 g，在料液比1∶20，pH 5.0，溫度50 ℃，提取時間2 h 的條件下，分別加入不同質量分數（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）的纖維素酶提取多糖，依據竹筍多糖提取率，分析纖維素酶添加量對竹筍多糖提取率的影響。每組進行3 次平行試驗，結果為其平均值。中性蛋白酶與果膠酶同樣按照以上步驟得到竹筍多糖提取率平均值。

2.4.1.2 正交實驗

在上述單因素實驗基礎上，按照表1 進行三因素三水平正交試驗，按照2.2 的試驗步驟，保持酶解條件不變，以復合酶比為自變量，竹筍多糖提取率為指標。確定提取竹筍多糖的最佳復合酶配比。試驗重復3 次，結果取平均值。

表1 復合酶法提取竹筍多糖的正交實驗變量水平設計因素與水平

2.4.2 復合酶提取條件的優化

2.4.2.1 單因素實驗

分別以其中一個提取條件的因素水平為自變量，保持2.4.1 所確定的最佳酶配比及其他條件不變，按照2.2 的步驟進行試驗并記錄相關數據，例如研究不同料液比對竹筍多糖提取率影響時，保持復合酶添加量、pH、提取溫度和提取時間不變，僅改變料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50。研究不同的復合酶添加量（1%、1.5%、2%、2.5%、3%），提取溫度（40、50、60、70 ℃），pH（4、4.5、5、5.5、6）和提取時間（1、1.5、2、2.5、3 h）對于竹筍多糖提取率的影響時，同樣依據上述方法，每組分別進行3 次平行測定，取平均值。

2.4.2.2 正交試驗

根據上述單因素試驗結果，對提取時間、提取溫度、pH、復合酶添加量4 個因素開展正交試驗確定最佳提取工藝參數（見表2），并考察各因素對竹筍多糖提取率影響關系。

表2 正交實驗變量水平設計

2.5 抗氧化活性的測定

2.5.1 竹筍多糖對DPPH 自由基清除能力的測定

首先配制2 mL 不同濃度（0.5，1.0，1.5，2.0，3.0 mg/mL）待測竹筍多糖溶液，分別加2 mL 0.2 mmol/L DPPH 溶液，另用無水乙醇調零，避光放置30 min，在波長517 nm 處測吸光度，進行3 次平行測定，用Vc 作為陽性對照。計算公式[20]如下：

式中：Aj為待測樣品溶液+DPPH 溶液的吸光度；Ai為待測樣品溶液+無水乙醇溶液的吸光度；Ac為無水乙醇溶液+DPPH 溶液的吸光度。

2.5.2 清除羥基自由基能力的測定

配制10 mmol/L 的硫酸亞鐵溶液和10 mmol/L的水楊酸（乙醇）溶液，再將它們依次各取1 mL 加入試管，加入1 mL 不同濃度的竹筍多糖溶液。加8.8 mmol/L 的過氧化氫溶液1 mL 激活反應，37 ℃水浴反應10 min。在510 nm 測吸光度，進行3 次平行測定取平均值，用Vc 做陽性對照[21]。羥基自由基清除率的公式為：

式中：AS為不同濃度待測溶液測得的吸光值；A0為蒸餾水代替待測溶液測得的吸光度值；A1為不加顯色劑過氧化氫時溶液的吸光度值。

2.5.3 還原能力的測定

用2.5 mL 0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液分別穩定1 mL 不同濃度多糖溶液的pH。再加入2.5 mL 1%的 K3[Fe(CN)6]溶液，50 ℃水浴20 min。冷卻后，加入2.5 mL 10%的TCA 溶液，4 000 r/min 離心10 min 后取上清液2.5 mL，加2.5 mL 蒸餾水和0.5 mL 0.1%Fecl3溶液混勻放置1 min，在波長700 nm測吸光度值[22]。每組進行3 次平行測定取平均值，用Vc 溶液對比。

2.5.4 多糖對ABTS 自由基清除能力測定

配制ABTS工作液：1∶1混合ABTS溶液（7.00 mmol/L）與過二硫酸鉀溶液（2.45 mmol/L），在25 ℃下避光反應12～16 h 后用pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液（0.1 mmol/L）稀釋，保證上述配制溶液在734 nm 處吸光值處于一定區域（0.7±0.02）之間。取0.4 mL 質量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/mL的多糖溶液置于試管中，加入4 mL 配制好的ABTS 工作液混勻，避光反應6 min，在734 nm 處測多糖溶液吸光度值[23]。每組3 次重復測定取平均值，以Vc 做對照。竹筍多糖對ABTS 清除率公式如下：

2.6 數據處理

采用Excel 軟件進行數據處理，Origin 2019 軟件繪圖。所有樣品均平行測定3 次，測定結果以平均值表示。

3 結果與分析

3.1 復合酶法提取竹筍多糖工藝條件確定

3.1.1 復合酶配比的確定

3.1.1.1 單因素實驗結果

如圖1 所示，竹筍多糖提取率在纖維素酶添加量1.5%時出現最高值4.11%。在此之后隨著添加量的增加，竹筍多糖提取率反而緩慢降低；圖2 顯示中性蛋白酶添加量在0.5%～2.5%的范圍內時，竹筍多糖得率隨著添加量的升高而增加，此后繼續增加后多糖得率緩慢下降，最高提取率為4.62%；如圖3 所示，果膠酶添加量為1.5%時多糖提取率出現最大值4.07%。之后隨著果膠酶量的增加，提取率慢慢降低。原因可能是竹筍多糖主要是由纖維素、果膠和幾丁質、半纖維素等成分構成的木素結合層，竹筍多糖存在于緊密的細胞壁內，而不同種類及添加量的酶能使幾丁質、半纖維素等與竹筍多糖分離，有助于多糖脫離出來，從而提高了多糖在溶劑中的溶解度[24]。

圖1 纖維素酶添加量對提取率的影響

圖2 中性蛋白酶添加量對提取率的影響

圖3 果膠酶添加量對提取率的影響

3.1.1.2 正交試驗結果

復合酶用量正交試驗結果與分析從正交試驗結果（表3）得出，3 種因素對多糖提取率影響的大小分別為B＞A＞C，即：中性蛋白酶＞纖維素酶＞果膠酶，復合酶最佳酶用量組合為：A2B2C3，即纖維素酶添加量1.5%，中性蛋白酶添加量2%，果膠酶添加量1.5%。以正交設計優化的復合酶用量為參照，經3 組平行試驗，驗證得竹筍多糖提取率為5.5%，大于復合酶用量單因素考察時，竹筍多糖提取率最大值4.62%。

表3 正交實驗設計和結果分析

3.1.2 最優提取條件的確定

3.1.2.1 單因素試驗結果

1）料液比對竹筍多糖提取率的影響。如圖4所示，料液比逐漸增大時，竹筍提取率先隨之逐漸升高后又降低，竹筍多糖提取率最大時為5.48%。隨著增大溶劑用量，溶液被稀釋導致竹筍的多糖提取率呈降低趨勢，所以試驗確定1∶20 為竹筍多糖提取的最佳料液比。早期階段，竹筍多糖的提取率上升可能是由于整個體系的溶劑增多增加了竹筍粉與酶的接觸面積，增加了竹筍多糖的濃度迫使更多的多糖被溶出，但料液比達到1∶20 后，溶劑繼續增加使得復合酶濃度降低，導致竹筍多糖提取率降低[25]。所以本實驗最終選擇1:20 的料液比。

圖4 料液比對提取率的影響

2）復合酶添加量對竹筍多糖提取率的影響。如圖5 所示，結果表明：竹筍多糖提取率隨復合酶添加量的增加先升高后降低，復合酶加入量2%時竹筍多糖提取率最高為5.69%。這可能是因為當酶濃度較低時，竹筍的酶水解不足，當酶使用量較高時，竹筍多糖中的一些多糖會被過度分解[26]，使得一些纖維素分解成可溶于水的小分子碎片，導致竹筍多糖提取率下降[27]。所以本實驗最終選擇1.5%、2%和3%的復合酶用量進行正交試驗。

圖5 復合酶添加量對提取率的影響

3）pH 對竹筍多糖提取率的影響。結果如圖6所示，竹筍多糖提取率隨著pH 的增大先升高后，在pH 為4.5 時，酶解效果最佳，此時竹筍多糖提取率為5.12%。這可能是由于pH 影響了酶的可電離基團的電離，從而影響酶與底物的結合，高于或低于最適pH 都會破壞酶的穩定性，影響酶解反應，且這種破壞是不可逆的。所以本實驗選擇pH=4、4.5、5 進行正交試驗。

圖6 酶解pH 對多糖提取率的影響

4）提取溫度對竹筍多糖提取率的影響。結果如圖7 所示，竹筍多糖的提取率在0～50 ℃時逐漸升高，在50 ℃后呈現降低趨勢，竹筍多糖的提取率達到峰值，為5.53%，因為當酶解反應的溫度小于50 ℃時，酶的活性受到抑制使得竹筍多糖的提取率偏低，在超過酶的最適溫度后，酶發生熱變性[28]，其空間結構被改變，催化能力也逐漸降低，導致多糖的提取率降低。所以本實驗最終選擇40、50、60 ℃進行正交試驗。

圖7 酶解溫度對提取率的影響

5）提取時間對竹筍多糖提取率的影響。由圖8 可知，竹筍多糖得率在0～2 h 時增加，當酶解時間達到2 h 時，酶與底物充分反應，得到有竹筍多糖最大提取率5.53%，隨著酶解時間繼續延長，竹筍多糖提取率下降。可能是酶解時間過長，一些小分子量的多糖會附著在大分子蛋白上，在醇沉過程中被除去；同時由于時間延長太多，也可能會造成酶解液被破壞，促使多糖提取率下降[29]。因此，本文最終選擇1.5、2、2.5 h 進行正交實驗。

圖8 酶解時間對提取率的影響

3.1.2.2 提取條件的正交試驗結果

根據極差Rj分析結果得出，4 個因素中影響竹筍多糖提取率關系為：提取時間A＞復合酶添加量D＞pHC＞提取溫度B。通過正交試驗（見表4）得出的結果顯示復合酶法提取竹筍多糖最佳工藝條件組合是：A3B2C1D3，在此條件下得到最高竹筍多糖提取率為6.00%。此次正交試驗結果所確定的復合酶法提取竹筍多糖的最佳條件：提取時間2.5 h，溫度50 ℃，pH 4，復合酶加入量2.5%，料液比1∶ 20。

表4 提取條件正交實驗設計和結果分析

3.2 竹筍多糖的抗氧化結果

3.2.1 DPPH 自由基清除能力的測定

由圖9 可知，竹筍多糖對DPPH 自由基具有一定的抑制效果，清除自由基的效果隨竹筍多糖濃度的增加而逐漸增大，竹筍多糖溶液濃度達到1.5 mg/mL后對DPPH 自由基的清除率呈現平穩的趨勢，穩定在30%左右。Vc 的清除率穩定在90%以上，由此可見，與Vc 相比，竹筍多糖對DPPH 自由基的清除率不明顯。

圖9 對DPPH 自由基清除能力的測定

劉煥燕等[30]研究發現毛竹筍殼的精制多糖溶液對DPPH 自由基具有明顯的清除效果，在濃度0.5 mg/mL，精制多糖溶液對DPPH 的清除率已經超過50%，高于本實驗數據，原因可能是原料采用的竹筍部位不同；并且本試驗所測定的是竹筍提取多糖液，多糖純度較低。

3.2.2 清除羥基自由基能力的測定

由圖10 可知，竹筍多糖質量濃度在0.5～1 mg/mL 之間對羥基自由基清除率穩定增長。當質量濃度在1～1.5 mg/mL 時清除率變化不大穩定在22%左右，當質量濃度在1.5～3 mg/mL 對羥基自由基清除率緩慢上升，并有持續增長的趨勢。而Vc 的清除率隨質量濃度變化清除率波動不大穩定在82%左右。由此可見竹筍多糖對羥自由基的清除能力較弱。

圖10 清除羥基自由基能力的測定

陳莉華等[31]進行了竹筍多糖的體外抗氧化性活性測定試驗，結果顯示，在一定的濃度范圍，竹筍多糖的抗氧化活性與濃度呈現正相關。竹筍多糖對羥基自由基顯示出了一定清除抑制效果，最適濃度下竹筍多糖溶液對羥自由基清除率可達到47%，高于本實驗測得數據，原因可能是由于該文采用的是超聲波輔助水提法并且后續經過醇沉去除了色素和蛋白，所得到的竹筍多糖純化液中多糖濃度更高。

3.2.3 還原能力的測定

由圖11 可知，隨竹筍多糖質量濃度的增加，還原能力幾乎呈直線上升，當質量濃度到2 mg/mL 后趨于平穩，吸光值穩定在0.38 左右。Vc 的還原能力波動不大，其吸光度值穩定在1.5 左右。王靜[32]探究了竹筍多糖還原力能力。結果表明，隨著竹筍多糖的增加，其還原力也隨之提高，與Vc 相比，雖然還原力較弱，但也有一定的效果。

圖11 還原能力的測定

3.2.4 ABTS 自由基清除能力測定

由圖12 可知，隨著竹筍多糖質量濃度增大時，其對ABTS 自由基的清除效果呈現出明顯增強的趨勢，對ABTS 自由基的清除率最高接近80%，與Vc 的差距明顯縮小，說明竹筍多糖對ABTS 自由基具有很顯著的清除效果。

圖12 對ABTS 的清除能力的測定l

陳曉燕等[33]測定了竹筍多糖對ABTS 自由基的清除能力，結果顯示在竹筍多糖溶液濃度為5 mg/mL 時，竹筍多糖的ABTS 自由基清除率可達86.5%，與本試驗結果相符。

4 結論

本實驗采用多種酶復合提取竹筍多糖，確定了提取竹筍多糖的復合酶的最佳配比為：纖維素酶添加量1.5%，中性蛋白酶添加量2%，果膠酶添加量1.5%；并通過正交實驗優化得到最優提取工藝條件為料液比1∶20、提取時間2.5 h、復合酶添加量為2.5%、pH 為4、溫度50 ℃，在此條件下得到最高提取率是6.00%。鄭炯等[11]采用超聲輔助提取竹筍多糖，多糖得率為2.49%，張帥[12]采用微波-超聲波聯合輔助提取竹筍多糖，多糖得率為2.76%，相比之下，本實驗采用的提取方法提取率分別增加了141%和117%。由此可以驗證，本文方法用于提取筍多糖不僅條件溫和，提取效果也更佳。在提取時間、提取溫度、pH 和酶添加量等因素中，對多糖得率的影響最大的是提取時間，影響最小的是提取溫度。研究表明，竹筍多糖有一定的體外抗氧化活性，特別是對ABTS 清除率作用很明顯，對DPPH自由基、羥基自由基也有一定的清除能力和還原能力，對未來竹筍多糖在保健品方面的開發具有研究價值。