電壓擾動對EAD代謝通量中微生物與關鍵酶活性的影響

劉海波，王楠，劉洪周，陳鐵柱，李建昌

（云南師范大學能源與環境科學學院，云南 昆明 650500）

引 言

微生物電解池（microbial electrolysis cell，MEC）是利用微生物催化的陽極降解有機廢棄物或廢水，并產生電子和質子，在電解電壓作用下，電子經外電路遷移至陰極，而質子在電遷移、對流和擴散作用下經本體溶液遷移至陰極，質子在陰極被還原而產生氫氣，為生產氫氣提供一種可持續的方式[1-2]。目前，MEC 耦合厭氧消化（anaerobic digestion，AD）可促進甲烷轉化率、提高沼氣品質，在厭氧消化領域中是新的發現[3-4]，因該技術是在AD 中耦合MEC，所以將MEC-AD 暫稱之為“電化學厭氧消化”（electro-chemical anaerobic digestion，EAD）。EAD不僅可以減少CO2的排放，而且可提高頑固性化合物、復雜廢水的降解率和產甲烷的轉化率[5-9]。然而，EAD 系統中的微生物群落結構及活性對電解電壓的變化較為敏感，Yang 等[10]研究不同陽極電位（0、0.2、0.4、0.6 V）對EAD 陽極膜微生物的影響中發現，當陽極電位為0.4 V 時，陽極生物膜有較高的電活性和胞外電子傳遞效率。因此，對于復雜的非線性的EAD 系統而言，為EAD 提供適合的電解電壓是提高系統運行性能的關鍵因素[11]，但電解電壓如何影響微生物的生理代謝，進而影響相關酶的活性尚不清楚。

厭氧發酵產甲烷的本質是產甲烷微生物利用胞內的酶或者輔酶將簡單的甲基化合物和二氧化碳轉化成甲烷的過程。氧化型輔酶Ⅰ[系統名稱為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)]是生物代謝所必需的輔酶，對微生物細胞內的氧化還原反應至關重要，在微生物生長代謝中，NAD 參與氧化還原反應，將電子從一個反應攜帶到另一個反應[12]。CoI 作為氧化還原酶催化的氧化還原反應在新陳代謝的所有部分都至關重要，但這些反應的一個特別重要的功能是使營養物質能夠釋放儲存在相對較弱的氧雙鍵中的能量[13]，為細胞生長繁殖提供能量基礎。磷酸轉乙酰化酶（PTA）在發酵厭氧菌中無處不在，在乙酸代謝中起著不可或缺的作用。它可以催化乙酰基從乙酰磷酸到CoA 的可逆轉移，形成乙酰輔酶A 和磷酸鹽[14]。乙酸激酶（AK）通過在ATP 和二價陽離子存在下磷酸化乙酸來促進乙酰輔酶A 的產生。AK 與PTA 一起催化乙酸鹽和乙酰輔酶A 相互轉化，通過AK 所產生的乙酸在碳循環中被細菌作為碳和能量的來源。然而，乙酸幾乎是所有發酵微生物的產物，反過來又可作為乙酸營養型產甲烷菌的生長底物。

因此，在EAD 反應體系中酶是主導代謝的關鍵。環境因子如電解電壓和pH 等是影響微生物代謝活性的變量，而代謝通量分析作為目前研究生物代謝網絡技術的重要方式之一[15-16]，無疑為EAD 的微生物代謝提供了強有力的分析手段。目前，代謝通量分析（MFA）因分析方法[15]、數據處理和評估方面所涉及的技術已日趨完善而在代謝工程中廣泛應用[15,17]。例如，Gonzalez-Garcia 等[18]利用混合培養的接種物將葡萄糖分解產生H2，建立了比較完整的代謝通量網絡，并計算出代謝網絡的通量。Li 等[19]在微生物發酵過程中豐富了Shewanella oneidensis的代謝通量水平，從而提高了電化學反應過程中的NADH∕NAD+的總水平，明顯加快了胞外電子傳遞（extracellular electron transfer，EET）速率。Rafieenia等[20]利用蔗糖、果糖、半乳糖、甘露糖、海藻糖和核糖6 種不同碳源建立了丁酸梭菌代謝網絡模型，研究了丁酸梭菌發酵制氫的過程，并且計算出了NADH通量是影響H2產生的重要輔助因子。因此，代謝通量分析為量化環境變量擾動下的代謝通量提供了清晰的思路。

為此，本研究利用代謝通量分析法對EAD 體系的代謝過程進行量化，直觀地展示電解電壓擾動后各代謝途徑的通量變化，并結合微生物群落結構和關鍵節點處的酶活水平揭示電壓擾動對EAD 代謝通量中微生物與關鍵酶活性的影響。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗裝置

EAD 裝置由電化學單元、EAD 發酵單元、集氣單元組成，如圖1 所示。發酵罐有效容積為400 ml，由橡膠塞密封，橡膠塞設有取氣口、排氣口、取樣口及電極插口。陽極為石墨電極（30 mm× 30 mm×2 mm），陰極為鉑電極（30 mm×30 mm×0.2 mm），參比電極為飽和Ag∕AgCl電極。設置電極距離為3.0 cm，并將電極片浸沒于發酵液中，電極通過銅線引出與寬屏無紙記錄儀（SIN-R7000A，中國）相連。

圖1 EAD實驗裝置a—電解電流及電壓記錄單元;b—EAD反應單元;c—排水集氣單元;1—pH測定、投料及取樣口;2—取氣口;3—發酵罐;4—攪拌子;5—恒溫磁力攪拌器;6—寬屏無紙記錄儀;7—石墨電極;8—鉑電極;9—玻璃三通;10—密封蓋;11—集氣瓶;12—量筒Fig.1 EAD experimental setup a—electrolytic current and voltage recording unit;b—EAD reaction unit;c—drainage gas gathering unit;1—pH determination,feeding and sampling port;2—intake port;3—fermentation tank;4—stirner;5—thermostatic magnetic stirrer;6—broadscreen paperless recorder;7—graphite electrode;8—platinum electrode;9—glass tee;10—sealing cover;11—collector;12—gauge tube

1.2 接種物

接種物來自云南師范大學昆明實驗室經豬糞厭氧發酵后的厭氧污泥，其pH 為8.07，TS 為17.11%，VS為10.08%。

1.3 緩沖營養液

緩沖營養液的成分及配比：NaH2PO4·2H2O（5.54 g·L-1），Na2HPO4·12H2O（23.088 g·L-1），KCl（0.26 g·L-1）和NH4Cl（0.62 g·L-1）。

1.4 微量元素液

微量元素液的成分及配比：Na2WO4·2H2O（0.025 g·L-1），NaCl（1 g·L-1），FeCl2·7H2O（0.072 g·L-1），CuSO4·5H2O（0.01 g·L-1），NiCl2·6H2O（0.024 g·L-1），C6H9NO6（1.5 g·L-1），MgSO4（3 g·L-1），AlK(SO4)2·12H2O（0.01 g·L-1），ZnCl2（0.13 g·L-1），CaCl2·2H2O（0.1 g·L-1），H3BO3（0.01 g·L-1），MnCl2·4H2O（0.6 g·L-1），CoCl2·6H2O（0.1 g·L-1），Na2MoO4（0.025 g·L-1）和復合維生素（1 粒·L-1）。

1.5 實驗方法

EAD 實驗組三組平行運行。啟動時，反應器中接種120.0 g厭氧污泥，100.0 ml緩沖營養液，10.0 ml微量元素液，底物加入量為1.0 g 葡萄糖，隨后用蒸餾水將反應器的總質量定至360.0 g。待發酵罐密封后，通入氮氣5 min，施加恒定電壓為1.0 V，并置于30℃恒溫磁力攪拌器中。此后，當pH 大于7時進行補料，補料量為1.0 g葡萄糖。在此條件下培養至擬穩態。

擾動階段：培養階段結束后，測定發酵液中底物和代謝產物的濃度。同時，記下該時間點為擾動的初始點（設為S點），隨后添加1.0 g葡萄糖，施加電壓擾動（0.6、1.0、1.4 V），通過監測體系中底物的消耗量和代謝產物的生成量，進行代謝通量分析。電壓擾動僅是為了獲得變化的通量數據，不作為電解電壓對EAD的影響的依據。

1.6 檢測分析

采用排水法收集記錄日產氣量。在（105±5）℃下干燥并在（550±10）℃下馬弗爐燃燒1 h后，通過稱量法測量污泥的TS 和VS。用pH 分析儀（HAOSHI H-1008A，中國）每24 h 記錄一次pH。通過5500 r∕min 離心7 min 獲得樣品消化物的上清液，通過氣相色譜儀（FULI, GC9790Ⅱ，中國）對VFA 進行檢測，色譜柱為KB- FFAP(30 m×0. 32 mm×0. 25 μm)，氣壓設置為總壓0.3 MPa，柱前壓0. 08 MPa，柱后壓0.06 MPa，氫氣壓0.1MPa，空氣壓0.1 MPa。進樣口溫度200℃，柱箱溫度130℃，FID 檢測器溫度250℃。通過氣相色譜儀（FULI,GC9790Ⅱ，中國）對H2、CH4和CO2含量進行分析，進樣器溫度為200℃，TCD 檢測器的溫度是200℃，柱溫是110℃，每次實驗取氣體樣品200 μl，運行時間10 min。葡萄糖含量：采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定。

1.7 微生物多樣性測定

測序前將樣品儲存于-80℃的超低溫冰箱中。采用CTAB∕SDS 法提取樣品總基因組DNA,用1%瓊脂凝膠測定DNA 濃度和純度，然后使用去離子水稀釋至濃度為l μg∕μl。首先用特異引物擴增出不同區域的16S rRNA基因，其中所有的PCR反應均使用15 μl 的Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix(新英格蘭)、0.2 μg 的正反向引物和約10 ng 的模板DNA。反應步驟為：在高溫98℃下變性1 min，再在98℃變性10 s循環30次，之后50℃退火30 s，最后在適宜溫度72℃下延伸30 s 并保持5 min。將相同體積的IX載液(含SYB green)與PCR 產物混合，在2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。PCR 產物按等密度比例混合。然后用Qiagen Gel Extraction Kit(Qiagen, 德國)對混合PCR 產物進行純化。最后使用TruSeq?DNA PCR-Free 樣品制備試劑盒(Illumina,美國)生成測序文庫，在Qubit@2.0 熒光儀(Thermo Scientific)和安捷倫生物分析儀2100 系統上進行評估。最后在Illumina NovaSeq 平臺上對文庫進行測序，生成250 bp的配對端reads。

1.8 酶活性測定

采用改良的雙抗體夾心酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）方法，以特定抗體為底物，根據比色定量酶活性[21]。ELISA 的原理是使抗體和酶復合物相結合，然后根據顯色反應的強度進行定性或定量分析。將抗原或抗體與酶連接形成酶標記的抗原或抗體，既保留免疫活性又保留酶活性[22]。在實驗過程中，以下成分被用作底物：純化的NADH 酶、磷酸轉乙酰化酶(PTA)、乙酸激酶(AK)、輔酶F420（CoF420）（上海濟寧生物技術有限公司，中國）。使用ELISA方法分析上述底物的微生物酶活性[22]。將與辣根過氧化物酶（HRP）標記的待測試酶對應的抗體合并以形成抗體-抗原-酶標記的抗體復合物，經過徹底洗滌后并添加3,3',5,5'-四甲基聯苯胺（TMB）底物顯色。在HRP 酶的催化下，TMB 變成藍色，在酸的作用下變成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中的酶含量呈正相關。用酶標儀在450 nm 的波長處測量吸光度（OD 值），并通過標準曲線計算樣品中酶的活性濃度。

2 實驗結果與討論

2.1 代謝通量分析

通量平衡分析（MFA）是微生物過程建模和分析代謝產物生產的最佳通量的一種方法，它可以用于研究環境變化對產物生產和細胞生長的影響。本研究采用代謝通量分析軟件（Cell Net Analyzer 2019.2）輔助，建立了EAD產甲烷代謝模型并計算出了相關代謝通量，如圖2 所示。表1 總結了該代謝模型中相關的代謝反應式。

表1 EAD產甲烷代謝途徑的反應式Table 1 Reaction formula of EAD methanogenesis metabolic pathway

丙酮酸是EAD 產甲烷代謝途徑中重要的代謝節點，與多種中間產物相聯系，包括甲酸、乳酸、乙醇和丙酸等多種胞外代謝產物，要想提高EAD 效益，需加快葡萄糖代謝產生丙酮酸的過程（R1）。EAD產甲烷代謝途徑中，NADH是一種輔助因子，有多個反應涉及到NADH 的生產與消耗。通過增加NADH 的量可以進一步提高氫氣的產率[23]。在本代謝途徑中，R6 是產生NADH 的主要反應，提高其產量可以有效促進氫氣的產生（R7）；R4 是丙酮酸轉化為乙酰輔酶A 的重要反應，同樣也是產生終產物CO2的途徑之一。H2的合成主要由糖酵解過程中合成的丙酮酸的厭氧代謝驅動，其來源主要有NADH和FdH（R7 和R8）。此外，氫氣產率和乙酸的產率有關，但在EAD 產甲烷途徑中，氫氣也可以由陰極通過電子傳遞途徑產生（R37）。甲烷來源主要有氫營養型產甲烷（R26）和噬乙酸型產甲烷(R29)。在實際過程中，甲烷的產率也與丁酸和丙酸的混合物有關[24]，同樣需要對此進行代謝通量的分析。由圖2代謝網絡可知，乙酸的產生途徑主要有R12、R18、R19、R20 和R21，其通量大小受多個中間產物的影響。乳酸是EAD 中影響較大的中間產物，因乳酸的生成需消耗一定量的NADH，且乳酸不易分解，會造成氫氣的產生受限，也會引起反應體系pH 的失衡。厭氧消化是一個復雜的微生物代謝過程，在某些情況下也可能會產生己酸（R32）、丙醇（R28）和丁醇（R34）等有機物。

圖2 EAD產甲烷過程的代謝途徑Fig.2 Metabolic pathways of EAD methanogenesis

2.2 電解電壓擾動對EAD產甲烷代謝通量的影響

圖3 顯示了根據表2 數據做出的電壓擾動對EAD 產甲烷代謝通量，該結果以H2、CO2和CH4為最終產物進行討論。電壓擾動后，各中間產物和最終產物均發生顯著變化。在0.6 V 擾動下，NADH 通量明顯優于1.4 V 電壓擾動，且此條件下最終產物甲烷通量達到0.5222 g，顯著高于1.0 V和1.4 V 下的0.2974 g 和0.3951 g，然而，產H2途徑的通量卻有所降低，說明電壓過低抑制了產氫，但卻增強了產甲烷途徑。0.6 V 和1.4 V 擾動下，通過H2還原CO2產生的甲烷（R26）分別占35%和40%，對照組為37%，表明電壓擾動使得EAD 產甲烷代謝途徑發生了改變。值得注意的是，EAD 產甲烷系統明顯產生了甲酸，但根據代謝通量，CH4和H2無一來源于甲酸，說明EAD 系統中可能沒有噬甲酸產甲烷菌存在。最終產物H2大多由EAD 中的陰極產生，但在最終產物中，氫氣通量明顯下降，說明H2還原為CH4（R26）的途徑較為活躍。此外，在發酵液中未檢測到己酸、丙醇和己酸鹽。乙酸可以從R12、R18、R19、R20 和R21 中得到，其通量大小受多個中間產物的影響，但在電壓擾動（0.6 V 和1.4 V）下，其通量明顯增大，其中0.6 V 擾動后增幅最大，說明反應器中的產酸微生物在此時相對較活躍。乳酸和乙醇的產生不利于H2的生產[25]，圖中1.4 V 擾動下的乳酸通量較高，這也可能是導致H2通量低的原因。

圖3 電壓擾動的EAD產甲烷代謝通量Fig.3 Voltage-perturbed EAD methanogenesis flux

表2 電壓擾動相關代謝物含量Table 2 Contents of metabolites related to voltage disturbance

2.3 微生物群落豐富度和多樣性分析

Alpha Diversity 用于分析樣本內微生物群落的豐富度和多樣性，并直觀表示測序深度和數據量情況，主 要 指 標 有Observed species、Shannon、ACE、Chao1、Goods coverage 和Simpon 指 數。 其 中Observed species（OTUs）表示直觀檢測到的樣本中微生物物種數，Shannon 指數表征樣本中微生物總數及其占比，可以表示微生物物種的多樣性和分布均勻性，ACE 表示群落中的OTU 數目，Chao1估計樣本中的物種總數，Goods coverage 代表本次測序的深度指數，其大小表示測序結果的準確性，Simpson 反映樣本微生物群落的多樣性。

表3 為陽極表面微生物的多樣性指數結果，可以發現，環境因子的擾動對EAD 陽極膜微生物群落的多樣性和豐富度影響較大，Goods coverage 數值均大于0.99，表示此次測序結果可靠度較高。 OTUs、Chao1 和ACE 的結果顯示，在低壓0.6 V、高壓1.4 V條件擾動下，陽極膜微生物物種種類得到了很大的增加，其中0.6 V 擾動下的微生物物種豐富度最高。Shannon 和Simpson 指數反映樣本中微生物多樣性，從表3 發現，在電壓擾動條件下的微生物多樣性明顯有所提升，結合代謝通量發現，這些條件下的產甲烷性能也較優。

表3 陽極膜微生物Alpha Diversity指數分析Table 3 Analysis of Alpha Diversity index of anodic film microorganisms

2.4 微生物群落結構變化分析

根據測序結果，篩選出各實驗組中相對豐度較大的優勢菌門，做出門水平下的微生物群落結構如圖4 所示。環境因子擾動下共有9 個優勢菌門，Firmicutes（厚壁菌門）、Desulfobacterota（脫硫桿菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）、Proteobacteria（變形菌門）和Actinobacteria(放線菌門)在EAD 產甲烷體系中的陽極生物膜上占主導地位；其中，Proteobacteria、Firmicutes 和Actinobacteria 包含了豐富的電活性細菌，可以提高細菌與電極之間的直接電子傳遞[21]，從圖4 中可以發現，這三種電活性菌門占比達到25%以上，說明陽極膜上可能存在大量的電活性菌。

圖4 環境因子擾動下的陽極膜上微生物門水平群落分布Fig.4 Community distribution of microbial phyla on the anode membrane under disturbance of environmental factors

在電壓擾動下，陽極膜上的Desulfobacterota 的相對豐度從未擾動（1.0 V）下的27.4%增加到擾動后的40.9%（0.6 V）和36.2%（1.4 V），Actinabacteria在擾動后含量明顯減少，而Firmicutes、Bacteroidetes和Proteobacteria 在短暫電壓沖擊下含量并無明顯變化。

以1%為閾值，對相對豐度較大的菌屬進行分配作圖，得到EAD 產甲烷體系中屬水平下的微生物群落結構如圖5所示。EAD 產甲烷體系中陽極膜上的Trichloromonas(三氯單胞菌屬)、Clostridium（梭菌屬）、Proteiniphilum（噬蛋白菌）、Syntrophnmonas（互營單胞菌屬）和Hydrogenophaga（噬氫菌）是發酵液中的優勢菌群。從圖5 中可以發現，Trichloromonas在陽極表面微生物群落中占據主導地位，Trichloromonas屬于本實驗中陽極膜上占主導地位的Desulfobacterota，可以利用厭氧消化中的中間產物，對厭氧消化具有重要作用。在電壓擾動下，Trichloromonas相對豐度有所增加，從未擾動的26.5%(1.0 V)升至擾動后的40.2%（0.6 V）和35.7（1.4 V），Clostridium、Syntrophomonas均在電壓未擾動時最高。電壓變化使得Hydrogenophaga的相對豐度從0.9%提高到3.1%（0.6 V）和3.5%（1.4 V），而Proteiniphium的相對豐度隨著電壓的升高逐漸降低。雖然，Trichloromonas在陽極膜上含量豐富，但關于其特性研究較少，需要對此進行進一步研究。

圖5 環境因子擾動下陽極膜上屬水平的微生物群落分布Fig.5 The distribution of microbial community at the genus level on the anode membrane under disturbance of environmental factors

2.5 酶活水平變化

圖6所示為葡萄糖代謝過程中關鍵酶活性的變化。圖6（a）反映CoI 的酶活性，由圖可以看出，在0.6 V 擾動時，CoI 酶活性最高，達到370 U∕L，在1.0 V 時，酶活性為138 U∕L，在1.4 V 時，酶活性也達到了245 U∕L。這是由于當進行電壓擾動時微生物體內的NADH∕NAD+變化直接影響細胞體內氧化還原反應的狀態，使微生物進行生長和代謝[26]，同微生物在門和屬上含量有較大變化相吻合。再結合EAD產甲烷代謝通量也可以看出，在0.6 V 時NADH∕NAD+代謝通量最大，且甲烷的代謝通量也達到最大。圖6（b）反映PTA 的活性，由圖可以看出，在1.0 V 時，酶活性為99 IU∕L，在1.4 V 時，酶活性為97 U∕L，在0.6 V 時，PTA 酶活性最高，達到115 U∕L。在乙酸代謝途徑中首要的是乙酸的活化，它首先由PTA進行催化，在ATP 參與下經AK 催化，乙酸被磷酸化為乙酰磷酸，然后乙酰磷酸再由PTA 催化生成乙酰輔酶A，進入三羧酸循環進行乙酸代謝[27-28]。圖6（c）反映AK 活性，當電壓為0.6 V 時，AK 酶活性為151 U∕L，電壓為1.4 V 時，AK 酶活性為120 U∕L，均比對照組1.0 V酶活性為106 U∕L高。乙酸代謝中PTA和AK 的酶活調節現象相似，有研究者發現[29]當谷氨酸棒桿菌生長在以乙酸(取代葡萄糖)為碳源的培養基上時，PTA 和AK 酶活性明顯提高，該現象是微生物碳代謝中葡萄糖效應的具體體現，它暗示著這些酶在基因表達環節上可能存在葡萄糖基質上的負調控效應或乙酸基質上的正調控效應[30]。在0.6 V 時，PTA 和AK 活性均達到最大值，而AK 酶活性大于PTA，這是由于在乙酸代謝途徑中，AK 催化產生大量ATP，使整個代謝過程能順利進行。圖6（d）反映CoF420的活性，在各種產甲烷的廣古細菌中普遍含有CoF420[31]。在H2還原CO2代謝途徑中，—CHO 被轉移給另一個C1載體四氫甲烷喋呤(H4MPT)，再依次被還原為次甲基( CH)、亞甲基( CH)和甲基(—CH3)，而催化這些反應需要CoF420作為電子載體[32]。從圖中可以看出，當電壓擾動為0.6 V時，CoF420酶活性增加，達到43 U∕L，比1.0 V 時40 U∕L 和1.4 V 時36 U∕L 酶活性高，酶活性增加，導致催化反應加快，這與代謝通量在0.6 V 時產甲烷通量最大實驗結果相符合。

圖6 EAD代謝途徑中酶活性水平的變化Fig.6 Changes in enzyme activity levels in EAD metabolic pathways

3 結 論

在0.6 V 擾動下，NADH 產甲烷通量明顯優于1.4 V 電壓擾動，此條件下最終產物甲烷通量達到0.5222，明 顯 高 于1.0 V 和1.4 V 下 的0.2974 和0.3951，表明電壓擾動使得EAD 產甲烷代謝途徑偏向氫營養型產甲烷。電壓擾動導致微生物群落發生變化，在電壓擾動下共有9 個優勢菌門，其中，Proteobacteria、Firmicutes 和Actinobacteria 包含了豐富的電活性細菌，這三種電活性菌門占比達到25%以上，陽極膜上的Desulfobacterota 的相對豐度從未擾動（1.0 V）下的27.4%增加到擾動后的40.9%（0.6 V）和36.2%（1.4 V）。CoI、PTA、AK 與CoF420均在0.6 V 擾動下酶活性最大，在0.6 V 電壓擾動下，產乙酸通量最小，而PTA 與AK 酶活性卻最大，這是由于乙酸逆反應生成乙酰輔酶A，而乙酰輔酶A 作為其他多個生化反應的底物，參與其他代謝途徑。本文結果可為環境因子擾動下的代謝通量、微生物和酶活分析提供參考。