血紅蛋白氧載體增強腫瘤治療效果研究進展

楊曉倩 陳紹水

濱州醫學院附屬醫院腫瘤科，濱州 256600

腫瘤是當今對人類壽命及生活質量影響最大的疾病之一，因此迫切需要有效的治療策略。然而由于腫瘤微環境（TME）的影響，現有治療措施并沒有達到人們對腫瘤治療效果好、生存率高、不良反應小、預后好的期望。缺氧是實體惡性腫瘤的常見和重要特征。腫瘤缺氧微環境與腫瘤進展、侵襲性增加、轉移潛力增強、腫瘤的轉移密切相關。另外，缺氧還能增加腫瘤對放化療等非手術治療的抵抗［1-2］。因此，增加腫瘤細胞含氧量對提高治療效果并抑制腫瘤生長和轉移有著重要意義。現如今，在世界范圍內多種改善腫瘤缺氧的措施已被開發并在腫瘤治療領域取得一定成果。具有攜氧功能的血紅蛋白氧載體（HBOCs）一直是提高組織氧含量的研究熱點，它具有保質期長、無需交叉配血、污染風險低等優點，最初被用作血液替代品，然而越來越多的研究表明HBOCs也有助于增加腫瘤氧合及放化療等抗腫瘤治療的敏感性，為緩解腫瘤缺氧提供了新的方法。隨著對其研究的不斷深入，現已取得了許多新的進展。本文將對近5年來HBOCs研究進展及其在緩解腫瘤缺氧、增強腫瘤治療效果方面的應用進行綜述，為臨床腫瘤治療提供參考。

HBOCs

1、化學修飾的血紅蛋白

化學修飾的方法主要是通過增大血紅蛋白分子半徑以減少血紅蛋白從腎臟濾過從而減少其對腎臟的損害并延長體內半衰期，以及降低血紅蛋白與氧的親和力使其更易在組織中釋放氧氣［3］。化學修飾的血紅蛋白主要包括共軛、聚合和交聯的血紅蛋白3種。

至今仍在使用且研究最廣泛的基于Hb的氧載體是HBOC-201（由馬薩諸塞州劍橋的Biopure開發的Hemopure），它是一種將純化的牛血紅蛋白與戊二醛聚合的氧載體，于2001年在南非獲得批準，用于治療患有急性貧血的成年外科手術患者。HBOC-201可以作為一種暫時性的氧橋，不僅可以在緊急情況下改善組織和器官的氧合，直至體內紅細胞恢復足夠的攜氧能力，還可以為缺血缺氧組織和器官提供氧氣，減輕缺血再灌注損傷［4］。然而，因HBOC-201增加心肌梗死與死亡風險有關而頗受爭議［5］，現只能通過擴大準入（EA）獲得。EA項目自2014年起在美國開展，主要針對因宗教信仰而拒絕輸血的患者［6］。目前，它還被美國和歐盟批準用于獸醫用途［7］。在針對器官保存和急性冠狀動脈綜合征等特殊應用方面，美國和歐盟的科學家仍在研究［8-9］。

Muller等［10］的研究發現，以聚合牛血紅蛋白（PolybHb）為代表的高分子量血紅蛋白在增加氧氣攜帶能力方面是安全和有效的，并且多聚血紅蛋白的氧氣親和力不影響組織的氧氣遞送或提取。另外，牛或人血紅蛋白被人血清白蛋白共價包裹制成的血紅蛋白-白蛋白簇（HbBv-HSA3和HbA-HSA3）作為紅細胞替代物的人工氧氣載體具有較低的滲透風險。Okamoto等［11］將其注入失血性休克大鼠體內，HbBv-HSA3和HbA-HSA3組與自體血復蘇組相比，血氣參數在兩組大鼠中均無顯著差異，表明HbBv-HSA3和HbA-HSA3簇可作為自體輸血的替代材料。

納米粒子作為血紅蛋白氧載體的新支架引起了廣泛關注。迄今為止最有希望的是二氧化硅納米粒子。有研究表明，人類血紅蛋白對二氧化硅納米顆粒具有高親和力，二氧化硅納米顆粒可以作為人類天然和突變血紅蛋白的效應器［12］。使用納米粒子控制血紅蛋白氧合為新型血紅蛋白氧合物的設計開辟了道路。近年來一些新發現的化學修飾劑包括聚多巴胺［13］、阿魏酸［14］等，均取得一定研究成果。

2、基因工程血紅蛋白

上述HbA-HSA3簇作為紅細胞的替代品需從過期的人紅細胞中獲取一定量的原始人血紅蛋白A（HbA），因此原料獲取有一定難度。如果將HbA-HSA3簇的原材料替換為重組蛋白，則無需捐獻的血液就可以產生完全合成的氧氣載體。Funaki等［15］描述了用重組人血清白蛋白（rHSAs）共價包被的轉基因成人血紅蛋白（rHbA）合成和氧氣親和力，作為人工氧氣載體的全合成紅細胞（RBC）替代品。由畢赤酵母表達的野生型rHbA具有與天然HbA相同的氨基酸序列和三維結構。研究發現這類載體具有中等低的氧氣親和力和高協同性，產生的最大氧氣轉運效率比人紅細胞高1.8倍［16］。因此，基因工程rHbA（X）-rHSA3簇有望成為一種新的氧傳遞產物，用于緩解腫瘤缺氧。

3、微囊包裹的血紅蛋白

將Hb包封在具有脂質雙層膜的脂質體中制成的氧載體稱為血紅蛋白囊泡（HbV）。它不僅能防止Hb與血液成分和內皮直接接觸，而且可以通過維持一氧化氮活性來減弱血管收縮作用。Takase等［17］研究的結果表明，HbV輸注對致死性失血性休克大鼠的預后有積極的影響，其程度與輸注洗滌紅細胞相當。然而，由于大量脂質體包囊進入體內會迅速被網狀內皮系統攝取從而干擾機體對其他異物的反應，科學家們研發出了可生物降解材料——聚乳酸，以此包裹Hb，其安全性相較脂質體更高，現已被美國FDA批準應用于臨床［18］。

4、新型血紅蛋白

現今正在研發的許多血液替代品是基于哺乳動物血紅蛋白，有科學家發現，無脊椎動物的天然細胞外血紅蛋白是有用的替代氧載體。法國Hemarina公司從名為Arenicola marina的海洋無脊椎動物體內提取到一種游離聚合Hb（HemO2Life），這種細胞外血紅蛋白的氧氣容量是脊椎動物血紅蛋白的40倍，它分子的大小比人類紅細胞小250倍，使其能夠更易將氧氣輸送到微循環的所有區域。HemO2Life現已作為保存溶液中的添加劑用于人體移植［19］。Asong-Fontem等［20］的研究表明HemO2Life可減輕大鼠脂肪肝靜態冷藏期間的缺血再灌注損傷。Zimmerman等［21］對比了6種無脊椎動物血紅蛋白的氧化速率、生理pH值下的解離、熱穩定性和氧氣傳輸特性等指標后，將陸生蚯蚓血紅蛋白和赤子愛勝蚓血紅蛋白確定為2種有前途的潛在血液替代品，值得未來研究。

HBOCs增強抗腫瘤治療效果

1、HBOCs增效化療

缺氧是腫瘤的一大特征，有充分證據表明，耐缺氧腫瘤細胞對大多數抗癌治療具有抗性：一方面深深嵌入腫瘤內部的無血管區域阻礙了化療藥物的遞送，另一方面缺氧被認為是誘導化療劑多藥耐藥的主要驅動力［22-23］。血紅蛋白氧載體黏度低、直徑小的特點使其易于在腫瘤組織與正常組織氧分壓差下深入腫瘤缺氧區域，增加腫瘤氧合和放化療敏感性［24］。YQ23是一種穩定的非聚合交聯四聚體血紅蛋白。有研究顯示YQ23可顯著抑制順鉑治療下肝癌細胞的增殖，并且在原位肝癌模型中，YQ23給藥顯著增加了基于順鉑的化療的療效［25］。此外，YQ23在對化療耐藥的食管鱗狀細胞癌也具有化療增敏劑的作用［26］。Jiang等［27］將血紅蛋白及化療藥物包裹在脂質體中分別制成血紅蛋白的脂質體（Hb@lipo）和化療藥物脂質（CBZ@lipo），并將他們應用至結腸癌及乳腺癌小鼠體內。實驗結果表明，Hb@lipo可以有效向腫瘤輸送氧氣，并降低轉移相關蛋白的產生，控制癌細胞的骨架和形態。在Hb@lipo的幫助下，腫瘤的缺氧狀態得到了顯著緩解。CBZ@lipo和Hb@lipo聯合用藥顯著抑制了腫瘤的生長，與單獨使用化療藥物和CBZ@lipo相比，這種聯合治療的策略在整個治療過程中明顯減少了癌細胞的轉移。董德操等［28］開發了一種聚合人臍帶血血紅蛋白氧載體（PolyCHb）可明顯改善腫瘤缺氧，延緩腫瘤生長并增加侖伐替尼化療的療效。

2、HBOCs增效放療

放療的主要機制是產生活性氧（ROS），進而不可逆轉地破壞腫瘤細胞DNA，導致細胞凋亡和細胞死亡［29］。殺死低氧細胞所需的輻射劑量是殺死常氧細胞的3倍，由于正常組織對輻射的耐受性有限，通常不可能增加輻射劑量來補償腫瘤低氧［30］。因此，可以增強癌細胞對輻射的敏感性的氧載體作為輻射增敏劑被引入以克服這些障礙。Gao等［31］開發了一種基于血紅蛋白和姜黃素的自組裝納米粒子，該納米顆粒可通過抑制細胞增殖和DNA損傷修復以及誘導凋亡，抑制肝癌細胞遷移，并增強缺氧肝癌細胞的放射敏感性。具有產生二次電子的高效率的金納米粒子已被證明是在X射線或γ射線照射下最有效的放射增敏劑之一［32］。Xia等［33］制備了負載金納米顆粒-血紅蛋白復合物納米顆粒的血小板（Au-Hb@PLT）。這些Au-Hb@PLT被腫瘤細胞激活后形成的血小板衍生顆粒（PM）可以將金納米顆粒-血紅蛋白復合物遞送到腫瘤組織深處，減輕缺氧并在低放療劑量下提高療效放療。

3、HBOCs增效免疫治療

免疫檢查點程序性細胞死亡蛋白1（PD-1）阻斷已在多種癌癥中顯示出有希望的抗腫瘤效果［34］。腫瘤缺氧可增加程序性細胞死亡蛋白配體1（PD-L1）的表達，從而降低細胞毒性T細胞對腫瘤細胞的殺傷力。因此，減輕缺氧可能是提高以PD-1阻斷為代表的腫瘤免疫治療療效的有效策略。Jiang等［35］的研究表明，Hb@lipo有助于改變TME中的細胞和免疫因子，使其從免疫抑制狀態轉變為免疫促進狀態，突破PD-1抗體治療瓶頸，顯著抑制乳腺癌的進展。Chow等［36］研究表明YQ23可通過緩解腫瘤缺氧從而抑制三陰乳腺癌細胞CD73和PD-1的表達，以此刺激宿主免疫反應來降低腫瘤生長。

4、HBOCs增效光動力療法（PDT）

活性氧的產生也可以通過PDT來實現。PDT需要施用光敏劑，光敏劑在受到照射后將其能量轉移到周圍組織中可用的氧，導致氧的不完全還原，從而產生ROS［37］。PDT的抗腫瘤作用受到低氧腫瘤微環境的阻礙，并受益于腫瘤氧水平的正常化。Dang等［37］創造了一種人造的假紅細胞（MMRBCs），應用生物膜重組技術制備的紅細胞膜（RBC膜）中包裹Hb和光敏劑，試驗結果表明，MMRBCs具有腫瘤積聚能力和對腫瘤內極度缺氧的PDT效力的高度耐受性，可顯著縮小甚至完全消除腫瘤［38-39］。Guo等［40］通過裝載Hb和光敏劑制備了生物相容性脂質體（LIH），用于增強針對低氧腫瘤的PDT。LIH可以積累到皮下和深部原位腫瘤中，在近紅外激光照射下，大量的氧可以被輸送到腫瘤中，用于光敏劑產生毒性ROS，進而殺死腫瘤細胞。與傳統的癌癥PDT相比，與氧載體聯合應用的PDT顯示出更大的療效，并證明了用納米技術調節腫瘤微環境以克服癌癥治療的局限性的前景。

5、HBOCs增效聲動力療法（SDT）

SDT是一種將聲敏劑與超聲波相結合的新興的腫瘤治療手段。聲敏劑可選擇性地在腫瘤細胞中聚集，并在超聲波的激活下產生ROS從而殺死腫瘤細胞［41］。然而，TME由于異常的腫瘤脈管系統而處于缺氧狀態，導致TME中谷胱甘肽（GSH）產生增加，吸收了SDT產生的ROS。因此，緩解腫瘤缺氧是發揮SDT療效的首要問題。Yin等［42］將HSA和Hb通過二硫鍵重構，然后封裝聲敏劑錳酞菁（MnPcS）設計了一種新的氧增強雜交蛋白納米敏化劑系統（MnPcS@HPO），該納米粒不僅能靶向腫瘤部位并緩解缺氧并且能在超聲照射下被激發誘導產生氧氣，誘導深層腫瘤細胞凋亡和壞死。Yuan等［43］通過將Hb封裝到ZIF-8納米載體中合成了Hb@ZIF-8（HZ）納米顆粒運輸氧氣和血紅蛋白，它在酸性TME中會分解釋放出大量氧氣，緩解腫瘤缺氧。體內試驗表明，在超聲輻照下，攜氧的HZ納米粒子不僅可以抑制皮下腫瘤的生長，還能抑制深部腫瘤的生長，實現不同深度的SDT。

6、HBOCs增效抗腫瘤聯合治療

由于不同抗腫瘤療法各自的局限性，單一的治療方法很難取得令人滿意的效果，聯合治療的方法已經被普遍應用于臨床。Xu等［44］將Hb與光敏劑二氫卟吩e6（Ce6）相連，并負載索拉非尼（SRF），構建了一種二合一納米平臺（SRF@Hb-Ce6），通過緩解腫瘤缺氧以及補充鐵增強PDT及索拉菲尼療效。SRF@Hb-Ce6納米平臺顯示了腫瘤治療的低毒性和高效率，為安全有效的腫瘤治療提供了有前途的策略。Sang等［45］將一種與Ce6修飾的多酚、放射增敏劑鉿（Hf）和Hb，所獲得的Hb@Hf-Ce6納米粒子不僅增強了RT-放射動力學療法（radiodynamic therapy，RDT）的治療效果，并且能調節缺氧的TME以逆轉免疫抑制，增強PD-1免疫檢查點阻斷促進抗腫瘤免疫反應。

小結與展望

缺氧是當前抗癌手段如放療、化療、免疫療法、PDT、SDT及聯合治療等的主要障礙。科學家已經嘗試了多種不同的方法來逆轉腫瘤缺氧，經過長時間的研究，在目前的臨床試驗中，基于Hb的氧載體可以通過對Hb進行化學修飾、微囊包裹以及開發新型Hb以產生理想的氧氣卸載特性并延長循環半衰期。多種HBOCs產品如PolyHeme、Hemospan和Hemotech等都已進入不同水平的臨床試驗，然而，需要進一步的研究來確定他們的臨床安全性和有效性。應該在已建立的解剖學和生理學相關的臨床前動物模型中系統研究無細胞化學修飾的聚合Hb設計與包封的Hb設計，比較循環停留時間、組織氧合功效、NO清除相關的高血壓風險和血液相關的毒性。另外，其他物種的Hb在很多方面顯示出較人類Hb在氧氣運輸調節及可獲得性等方面更大的優勢，以后的研究應多集中于研究此類Hb應用于人體的適應性及毒性問題。總之，本綜述的目的是為今后的研究提供參考。隨著科學研究的發展，找到更好緩解腫瘤缺氧的方法無疑對未來抗腫瘤研究具有重要意義。盡管如此，面對TME的復雜性和個體差異導致的異質性，尋求更好緩解腫瘤缺氧的方法并將其應用于腫瘤的臨床治療仍然任重道遠。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突