應用顯微掃描儀檢測臨床樣本中抗酸菌的假陽性與假陰性結果情況分析

黃業倫 劉欣 黃艷君 陳劍鋒 謝偉勝 羅少珍 劉志輝

廣州市胸科醫院檢驗科，廣州 510095

通信作者：劉志輝，Email：liuyixi2005@163.com

臨床標本涂片顯微鏡檢查找抗酸菌在結核病診斷中雖然靈敏度不高，但為簡便快速、經濟實用的實驗方法，與此同時也是指示結核病患者傳染性強弱、考察抗結核化療效果與治療轉歸、評價結核病控制效果的重要指標，目前尚無任何實驗診斷技術能取而代之［1-4］。涂片顯微鏡檢查找抗酸菌雖然技術不高深、方法也很簡單，但主觀性強，人為因素影響較大，劉志輝等［5］1995—2000 年3.3%的假陰性實驗室內質量控制結果即深刻說明了這一點。隨著電子計算機技術、信息化技術、神經網絡技術等的飛速發展，顯微鏡檢查找抗酸菌檢測已逐步向全自動制片、染色和鏡檢方向發展，基于抗酸染色或熒光染色檢測抗酸菌的顯微掃描儀已走進臨床實驗室，其效果如何目前我們尚未查見相關文獻報道，現將我們2019 年12 月至2020 年6 月進行的人、機檢測對比分析結果報道如下。

資料與方法

1、一般資料

采用試驗研究方法對比分析在廣州市胸科醫院檢驗科2019 年12 月至2020 年6 月的5 284 張金胺O 熒光染色涂片中進行研究。

2、儀器與試劑

結核分枝桿菌顯微掃描系統FS400 寧波舜宇儀器有限公司，金胺O 熒光染色試劑由實驗室自行配制，涂片采用與顯微掃描儀配套的載玻片。

3、金胺O熒光染色試劑配制

3.1、染色劑（金胺O 染液） 稱量金胺O 染液1 g，使之完全溶解在95%乙醇100 ml 中，另取50 ml 石碳酸液加在850 ml蒸餾水中，將此二液混合均勻（不必過濾），裝入褐色瓶中，放室溫保存。

3.2、脫色劑（3%～5%的鹽酸乙醇） 3 ml（或5 ml）35%濃鹽酸與97 ml（或95 ml）95%乙醇混合。

3.3、復染劑（0.5%高錳酸鉀水溶液） 稱量5 g 高錳酸鉀，加入1 000 ml蒸鎦水中搖勻。

4、實驗方法

包括標本收集、涂片、染色、鏡檢（人工鏡檢或顯微掃描檢測）、結果報告5 大步驟，實驗操作參照《結核病實驗室檢驗規程》［6］和結核分枝桿菌顯微掃描系統FS400操作說明書進行。其中，顯微掃描檢測的主要操作如下：檢查和啟動儀器、打開軟件，將染色好的玻片放在玻片架上（每架40 張）并置入儀器，點擊標準掃描，掃描速度5～7 min∕張。

5、顯微掃描結果人工復檢抽樣和顯微鏡檢

對所有儀器報告陽性涂片、約15%的儀器報告陰性涂片（隨機抽取）進行人工復檢，計算其假陽性率和假陰性率；對假陰性者，應用顯微鏡玻片夾坐標尺標注人工復檢到的抗酸菌在涂片中所在位置，估計其在儀器掃描區域內外的情況。

6、統計學方法

采用分類資料的統計描述方法手工計算顯微掃描系統檢測結果的假陽性率和假陰性率，人工復檢查見抗酸菌在儀器掃描區域內、外的發生率。

結 果

1、顯微掃描儀器系統假陽性與假陰性結果情況

在5 284張涂片中，儀器報告陽性1 290例，人工復檢報告陽性850例，假陽性率為34.11%（440∕1 290），這些涂片在顯微鏡下可觀察到短桿、散在點粒、雜質等熒光染色物；隨機抽查儀器報告陰性涂片665 張，人工復檢報告陽性100 例，假陰性率為15.04%，假陰性結果包括38 例±、50 例1+、6例2+、4例3+、2例4+。

2、儀器系統假陰性涂片人工復檢結果

⑴隨機抽查儀器報告陰性涂片665 例，人工復檢發現100 例假陰性涂片，鏡檢分級結果為±、1+、2+、3+、4+的 假 陰 性 率 分 別 為5.71%（38∕665）、7.52%（50∕665）、0.90%（6∕665）、0.60%（4∕665）、0.30%（2∕665）。⑵對于人工復檢分級結果為±、1+、2+、3+、4+的100例假陰性涂片，其落入到儀器閱片區域內和外的例數分別為11 和27、23 和27、3和3、3和1、2和0。

討 論

在涂片中見到的抗酸菌包括結核分枝桿菌復合群（Mycobacterium tuberculosis complex，MTC）、麻風分枝桿菌和非結核分枝桿菌（non-tuberculous Mycobacterium，NTM），而麻風病在我國已基本消除，故能想見各類臨床樣本中的抗酸菌主要為MTC 和NTM。對于NTM，目前全世界已經發現190余種并且不斷有新種發現，我國則分離到60余種，其引起疾病的發病率和患病率也有逐步增加的趨勢［7-9］。在實驗檢測中，廣州市胸科醫院結核病防治所實驗室1994—2003 年的NTM 分離率為6.28%［10］、住院部實驗室1998—2001 年的NTM 分離率為16.50%［11］，2012—2016 年廣州市越秀和海珠兩老城區的NTM 分離率為4.18%［12］；Zhou 等［13］的meta 分析則報道2000—2019 年間我國結核病疑似病例中NTM的粗分離率為4.66%～5.78%，NTM在所有分枝桿菌分離株中所占的比例為11.57%。由此可以推斷在涂片查找的抗酸菌中有10%左右的NTM。我們在光學顯微鏡下可以看到不同種類的分枝桿菌形態各異，結核分枝桿菌也分桿菌型、球菌型、顆粒型、濾過型4 種類型，單個散在時或呈人型、V 型、T 型、Y 型，多個細菌扭集在一起時可呈繩索狀、束狀或叢狀［14］，在人工顯微鏡檢判斷時即存在一定程度的主觀性。顯微掃描系統檢測抗酸菌屬于人工智能，其常用方法和模型包括人工神經網絡、深度神經網絡、卷積神經網絡和循環神經網絡，如何準確識別形態多樣的抗酸菌，則更有賴于機器深度學習中訓練數據的質與量，深度學習依賴于大量的標注數據，而標注數據的質量決定著深度學習模型訓練的結果［15］。李強等［16］評價了自動顯微鏡掃描系統的效果與人工鏡檢的陽性率相近，但兩者間的差異性沒有在形態學和掃描區域方面進行分析。在本文的分析結果中，顯微掃描系統檢測抗酸菌的假陽性率為34.11%，在人工復檢時也能看到涂片中短桿、散在點粒、雜質等熒光染色物，充分說明機器深度學習中訓練數據的質與量還相當不足，我們必須建立數量更多、質量更高的數據庫供儀器系統深度學習，以提高儀器系統的建模質量，不斷降低其假陽性情況的發生。哈艷等［17］應用增強圖卷積神經網絡對透射電子顯微鏡病毒圖像特征的識別的研究理念值得我們借鑒。與此同時，更需強調的是：對顯微掃描系統檢測陽性結果必須全部人工復檢，因為在臨床中抗酸菌檢測陽性即幾近確診為結核病（因為已于前述NTM 僅占10%左右），假陽性結果嚴重影響患者的臨床治療，只有當顯微掃描系統檢測與人工復檢結果達到高度一致時方可考慮適度降低對這一程序的要求，如按比例抽查人工復檢等。

顯微掃描系統檢測抗酸菌在高假陽性結果的同時，我們也得到了15.04%的假陰性結果，可以看到其原因有二：一是儀器系統對閱片域內的抗酸菌“認不清”，屬儀器系統建模質量問題；二是儀器系統對閱片域外的抗酸菌“看不到”，為儀器系統掃描區域設置問題。涂片染色查找抗酸菌靈敏度本來不高，如何提高是人們一直都在探討的課題，因此如何減少顯微掃描系統檢測抗酸菌假陰性結果，也是我們必須重視的問題，提高儀器系統建模質量、擴大儀器系統的掃描區域是解決問題的基本途徑。如何提高儀器系統建模質量已于上述，至于掃描區域如何擴大，則需兼顧檢測速度，大家在實踐中應予務實探索，結合樣本臨床信息對顯微掃描檢測陰性涂片進行適當比例的人工復檢可以在相當程度上彌補儀器系統的缺陷。

總之，高質量維護顯微掃描系統建模數據庫是儀器系統應用中的常態性工作，必須持之以恒；依據儀器系統檢測結果進行人工復檢，是保證檢驗正確的必要手段，必須常抓不懈。

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