miR-34a基于AKT/mTOR通路對骨關節炎大鼠的影響及作用機制研究

周倫 丁源 呂洲

青島市市立醫院骨關節科，青島 266000

骨關節炎是常見的骨骼疾病，疼痛、僵硬等臨床特征嚴重影響關節的承重能力，我國有80%的患者出現關節活動受限，嚴重影響患者的生活質量［1］。目前關于該病的研究表明，骨關節炎主要是由于細胞外基質、關節軟骨的合成、降解紊亂所造成［2］。當前基于微小RNA（miRNA）治療多種疾病已有大量研究，同時對于臨床具有較大的診斷、治療潛能，但治療骨關節炎的研究較少［3］。有研究表明，微小核糖核酸-34a（microRNA-34A，miR-34a）具有調控細胞周期和抗增殖能力，同時表達異常會引起細胞的凋亡、細胞周期停滯等現象［4］。蛋白激酶B（AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路主要對于細胞的調控、自噬具有重要作用，其中通過抑制該通路可以改善機體的炎性反應［5］。目前缺少通過AKT/mTOR 信號通路來調節miR-34a 對骨關節炎的干預效果研究。基于此，本文旨在研究miR-34a 基于AKT/mTOR通路對骨關節炎大鼠的影響及作用機制。

動物與材料

1、研究動物

研究時間為 2020 年 2 月至 2021 年 5 月。選取 43 只 6～9 周齡雄性SD 大鼠作前瞻性研究，體質量200～250 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號SCXK（京）2017-0022，喂養標準大鼠飼料，室溫（24±3）℃，相對濕度（48±7）%，12 h 光照交替。本次試驗操作均參照動物試驗倫理要求的相關規定，且經青島市市立醫院倫理委員會批準同意。

2、方法

2.1、骨關節炎大鼠建模［6］選取 43 只大鼠，從中隨機選取10 只大鼠為空白組，其余33 只建立骨關節炎模型大鼠，腹腔注射10%水合氯醛（青島宇龍海藻有限公司，H37022673）麻醉，切開2 cm 雙側膝關節內側，暴露關節腔，用生理鹽水清洗，止血，縫合。在關節中注射碘乙酸鈉溶液（上海信裕生物科技有限公司，型號305-53-3），飼養2 周，建模關節出現腫脹及屈伸功能障礙，表示建模成功。成功建模30只。

2.2、分組及干預 選取10 只大鼠為空白組，成功建模的30 只模型大鼠隨機分為模型組、上調miR-34a 組、沉默miR-34a 組，各 10 只。通過 Lipofectamine 2000 將 miR-34a inhibitor 轉染到上調 miR-34a 組、沉默 miR-34a 組，分別為400 nm 和 200 nm，6 h 后換成含10% 血清的DMEM 培養基（廣東環凱生物科技有限公司，貨號：XB01XLS），37 ℃，CO2培養箱培養48 h，實時熒光定量PCR（RT-PCR）法檢測miR-34a inhibitor 轉染效果。模型組、空白組均給予等體積的生理鹽水干預，各組均連續干預2周。

2.3、檢測炎癥指標 采用酶聯免疫吸附測定法檢測白細胞介素（interleukin，IL）-1β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-4、IL-10，在干預結束后抽取尾靜脈血5 ml，以離心半徑5 cm、轉速3 000 r/min 離心處理10 min，分離上層血清，-80 ℃保存待檢。嚴格按照說明書進行。酶聯免疫吸附試劑盒由上海酶聯生物科技有限公司提供。

2.4、病理組織觀察 干預50 d 后，處死大鼠，觀察關節是否有積液，取4 塊脛骨內側、脛骨外側為標本，標本使用中性甲醛溶液固定70 h，脫水，包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，根據Mankin關節軟骨病理評分標準進行評估。

2.5、采用實時熒光定量PCR 檢測miR-34a 采用Trizol一步法提取總RNA，所有步驟按說明書嚴格進行。引物設計如下 ， miR-34a正 向引物 ：5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ ， 反 向 引 物 ：5’-GCCGCTGGCAGTGTCTTAGCTG-3’；GAPDH正向引物：5’ -AGCCACATCGCTCAGACA-3’ ， 反 向 引 物 ：5’-TGGACTCCACGACGTACT-3’。采用 2-△△Ct方法計算出需要檢測的miR-34a相對表達量。

2.6、檢測磷酸化蛋白激酶B（pAKT）、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（pmTOR） 采用蛋白免疫印跡法將標本提取液，根據蛋白濃度取適量進行SDS-PAGE 電泳分離蛋白。其余步驟嚴格按照說明書進行，結果用LabWorks3.0軟件以目的條帶β-肌動蛋白（β-actin）的會度值進行分析。重復試驗5次。

3、統計學處理

采用SPSS 19.0 統計軟件進行分析處理。應用Kolmogorov-SmiRnov 檢驗數據是否符合正態分布，符合正態分布的計量資料采用均數±標準差（）描述，多組間比較采用方差齊性檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1、病理組織

如圖1 所示，圖1A 為空白組：未見明顯關節結構破壞，表面光滑沒有裂痕，骨細胞排列分布均勻；圖1B 為模型組：表面明顯粗糙，有裂隙，骨細胞減少偏平，分布紊亂；圖1C為沉默miR-34a 組：表面較為光滑無裂痕，骨細胞分布均勻，層次分明；圖1D 為上調miR-34a 組：表面粗糙，骨細胞減少，分布較為紊亂。

圖1 各組大鼠病理學觀察（HE ×400）。A 為空白組大鼠病理圖，B 為模型組大鼠病理圖，C 為沉默miR-34a 組大鼠病理圖，D為上調miR-34a組大鼠病理圖

2、miR-34a在各組中的表達水平比較

如表1 所示，與空白組相比，模型組、上調miR-34a 組、沉默miR-34a 組的miR-34a 表達較高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與模型組相比，上調 miR-34a 組、沉默miR-34a組miR-34a表達較低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；沉 默 miR-34a 組 與 上調 miR-34a 組相 比，沉 默miR-34a 組miR-34a 表達較低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

表1 miR-34a在各組大鼠中的表達水平比較（）

表1 miR-34a在各組大鼠中的表達水平比較（）

注：空白組不做處理，模型組建立骨關節炎模型，上調miR-34a組、沉默miR-34a 組建立骨關節炎模型后分別轉染400 nm 和200 nm miR-34a inhibitor；miR-34a 為微小核糖核酸-34a；與空白組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與上調miR-34a 組相比，cP＜0.05

miR-34a 0.94±0.08 2.39±0.26a 2.12±0.23ab 1.54±0.17abc 25.290 0.001組別空白組模型組上調miR-34a組沉默miR-34a組F值P值n 10 10 10 10

3、各組Makin評分比較

如表2 所示，與空白組相比，模型組、上調miR-34a 組、沉默miR-34a 組的Makin 評分較高，差異有統計學意義（均P＜0.05）；與模型組相比，上調miR-34a 組、沉默miR-34a 組的Makin 評分較低，差異有統計學意義（均P＜0.05）；沉默miR-34a 組與上調 miR-34a 組相比，沉默 miR-34a 組 Makin評分較低，差異有統計學意義（均P＜0.05）。

表2 Makin評分在各組大鼠中的比較（分，）

表2 Makin評分在各組大鼠中的比較（分，）

注：空白組不做處理，模型組建立骨關節炎模型，上調miR-34a組、沉默miR-34a 組建立骨關節炎模型后分別轉染400 nm 和200 nm miR-34a inhibitor；miR-34a 為微小核糖核酸-34a；與空白組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與上調miR-34a 組相比，cP＜0.05

Makin評分0.35±0.05 4.13±0.19a 3.02±0.16ab 1.15±0.09abc 91.260 0.001組別空白組模型組上調miR-34a組沉默miR-34a組F值P值n 10 10 10 10

4、各組炎性反應比較

如表3 所示，與空白組相比，模型組、上調miR-34a 組、沉默miR-34a組IL-1β、TNF-α較高，IL-4、IL-10較低，差異有統計學意義（均P＜0.05）；與模型組相比，上調miR-34a組、沉默 miR-34a 組IL-1β、TNF-α 較低，IL-4、IL-10 較高，差異有統計學意義（均P＜0.05）；沉默miR-34a 組與上調miR-34a 組相比，沉默 miR-34a 組 IL-1β、TNF-α 較低，IL-4、IL-10較高，差異有統計學意義（均P＜0.05）。

表3 各組大鼠的炎性反應比較（）

表3 各組大鼠的炎性反應比較（）

注：空白組不做處理，模型組建立骨關節炎模型，上調miR-34a 組、沉默miR-34a 組建立骨關節炎模型后分別轉染400 nm 和200 nm miR-34a inhibitor；miR-34a 為微小核糖核酸-34a；IL 為白細胞介素，TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；與空白組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與上調miR-34a組相比，cP＜0.05

IL-10（pg/ml）106.49±17.51 60.85±10.23a 76.81±13.07ab 91.05±15.02abc 10.676 0.001組別空白組模型組上調miR-34a組沉默miR-34a組F值P值n 10 10 10 10 IL-1β（ng/L）3.68±0.37 7.51±1.23a 5.72±0.95ab 4.63±0.72abc 14.144 0.001 TNF-α（ng/L）37.45±4.85 62.05±7.49a 56.26±6.25ab 43.85±5.10abc 13.077 0.001 IL-4（pg/ml）115.75±16.81 50.43±9.42a 75.82±11.94ab 93.85±13.86abc 16.080 0.001

5、各組AKT/mTOR通路蛋白相對表達量對比

如表4 所示，與空白組相比，模型組、上調miR-34a 組、沉默miR-34a組pAKT、pmTOR較高，差異有統計學意義（均P＜0.05）；與模型組相比，上調miR-34a 組、沉默miR-34a 組pAKT、pmTOR 較低，差異有統計學意義（均P＜0.05）；沉默miR-34a組與上調miR-34a組相比，沉默miR-34a組pAKT、pmTOR 較低，差異有統計學意義（均P＜0.05）。各組大鼠pAKT、pmTOR蛋白免疫印跡圖見圖2。

圖2 空白組、模型組、沉默miR-34a組、上調miR-34a組大鼠pAKT、pmTOR蛋白免疫印跡圖

表4 各組大鼠的pAKT、pmTOR蛋白相對表達量對比（）

表4 各組大鼠的pAKT、pmTOR蛋白相對表達量對比（）

注：空白組不做處理，模型組建立骨關節炎模型，上調miR-34a組、沉默miR-34a組建立骨關節炎模型后分別轉染400 nm和200 nm miR-34a inhibitor；miR-34a 為微小核糖核酸-34a，pAKT 為磷酸化蛋白激酶，pmTOR 為雷帕霉素靶蛋白；與空白組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05；與上調miR-34a組相比，cP＜0.05

pmTOR 1.00±0.01 1.89±0.24a 1.56±0.25ab 1.25±0.15abc 17.580 0.001組別空白組模型組上調miR-34a組沉默miR-34a組F值P值n 10 10 10 10 pAKT 1.00±0.01 1.95±0.29a 1.71±0.26ab 1.51±0.26abc 15.525 0.001

討 論

骨關節炎是一種退行性疾病，主要是以關節基質破壞、關節軟骨細胞減少為特點，嚴重者可導致患者出現關節畸形、功能喪失等問題，當時該病的發病機制尚未明確［7］。關于該病的治療目前沒有較好的方法，主要是以減輕疼痛、改善關節功能為主要治療方式，以提高生活質量為主要目的［8］。但是治療方式不甚理想，因此應更加深入了解病理機制，挖掘防治靶點。

miRNA 是一種普遍存在于生物體的小分子，其可以通過調節別的miRNA 來實現基因的調控，參與多種疾病中，尤其對于人體神經分化、細胞凋亡、增殖具有重大作用，是一重要的調節因子［9-10］。隨著對miRNA 的深入了解發現，miR-34a 與骨質疏松癥、骨腫瘤、骨關節炎等疾病的發生、發展具有密切關系。主要是因為miR-34a 可調節細胞增殖、凋亡等生理學行為［11-12］。有研究結果顯示，通過miR-34a 進行沉默，可以起到保護軟骨細胞的作用，同時可以抑制軟骨細胞凋亡，延緩關節退變的速度，對于治療骨關節炎提供了較好的理論支持［13］。本文研究結果顯示，在骨關節炎中miR-34a 表達較高，通過沉默miR-34a 可以降低大鼠miR-34a 表達，減輕大鼠的炎性反應，從而影響骨關節炎的發生、發展。主要是因為miR-34a 通過誘導p53 基因，進而導致細胞周期停止、凋亡、衰老等生物學行為，同時通過導致基因的變化對細胞進行較好的干預，因此對骨關節炎造成一定的影響［14］。

IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10 是較為經典的炎性指標，對于骨關節炎的發病機制有一定影響。miR-34a 對于細胞的自噬作用有一定影響，而自噬是機體中較為穩態的一種機制，主要是通過吞噬受損的細胞器、蛋白質，從而釋放原料，為機體提供新的能量，因此在炎癥、免疫等指標中具有重要作用［15］。由此說明，miR-34a 對于炎癥指標有一定影響性。本文研究結果顯示，沉默miR-34a 可以使骨關節炎大鼠的IL-1β、TNF-α降低，IL-4、IL-10升高，減輕炎性反應。主要是因為IL-1β 可以誘導軟骨產生較多的IL-6、IL-8 等炎癥介質［16］。TNF-α 可抑制軟骨膠原產生，與病變具有密切關系［17］。IL-10對軟骨細胞具有保護作用，充分說明該炎癥指標與骨關節炎的發生、發展具有密切的相關性。

mTOR 與細胞的增殖、凋亡、分化具有密切的相關性，同時有學者研究發現，以mTOR 為交點的正向信號通路有AKT/mTOR 通路［18］。同時有研究表明，AKT/mTOR 參與調控細胞的凋亡、自噬，可以影響更多的反向效應分子，從而起到抑制細胞自噬作用［19］。本文研究結果顯示，沉默miR-34a可以降低骨關節炎大鼠pAKT、pmTOR 表達。分析原因主要是因為沉默miR-34a 可以通過去磷酸化的三磷酸磷脂酰肌醇抑制AKT 活性，而激活AKT/mTOR 信號通路之后，可以引起一系列反應，包括調控細胞的生長、增殖、自噬［20］。

綜上所述，沉默miR-34a 通過AKT/mTOR 信號通路調控，進而改善pAKT、pmTOR 表達，提高大鼠的關節功能，減少炎性反應，為臨床骨關節炎靶向治療提供理論依據。但因樣本量較少，在數據統計時可能存在一定的偏倚，存在一定的局限性，且未對其具體作用機制進行深入分析，因此還需后續進一步分析。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突