CK19及Galectin-3在甲狀腺乳頭狀癌合并橋本氏甲狀腺炎的表達及臨床意義

高 丹 吳 影 付雪蓮 李淑蓮 李化敏 董祥梅 付 瑤

（牡丹江醫學院附屬紅旗醫院病理診斷中心，黑龍江 牡丹江， 157000）

近年來甲狀腺癌發病率明顯上升，且女性發病率明顯高于男性[1]。臨床病理將甲狀腺癌主要分為甲狀腺髓樣癌、濾泡狀甲狀腺癌、甲狀腺乳頭狀癌和未分化甲狀腺癌。甲狀腺乳頭狀癌（PCT）是最常見的一種甲狀腺癌類型，占80%左右，多表現為甲狀腺腫塊與淋巴結腫大，多在體檢過程中發現[2]。PCT的惡性程度在所有甲狀腺癌病理分型中最輕微，而且一般患者病程進展緩慢，預后相對良好。橋本甲狀腺炎（HT）屬于自身免疫性疾病的一種，患者伴隨典型的甲狀腺分泌過多，屬于臨床常見病與多發病。HT多發病緩慢，但是患者病程較長，容易反復發作。隨著臨床上對甲狀腺乳頭狀癌和橋本甲狀腺炎研究進展加深，許多學者認為，HT可以演變成PCT，且臨床上兩者共同發病的情況比較多見[3]。隨著臨床醫學發展，雖然多數甲狀腺乳頭狀癌能夠在超聲下觀察其良惡性病變程度，但是仍然需要病理組織檢驗作為診斷的金標準[4]。在病理診斷中，由于甲狀腺乳頭狀癌合并橋本氏甲狀腺炎（PCT-HT）的特殊性，單純依照形態學診斷較為困難。隨著生物分子學研究進展加深，多數學者認為[5-6]，應用醫學分子標記物能夠有助于診斷PCT-HT。因此，本研究分析細胞角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）及半乳糖凝集素-3（Gralection-3）在PCT-HT的表達及臨床意義，具體報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年8月～2021年8月牡丹江醫學院附屬紅旗醫院收治的100例PCT-HT患者作為觀察組，另選取同期來牡丹江醫學院附屬紅旗醫院治療的100例單純甲狀腺乳頭狀癌患者作為對照組，進行回顧性分析。對照組患者中，男33例，女67例；年齡38～62歲，平均年齡（51.30±3.57）歲；病程1～3年，平均病程（2.03±0.24）年。觀察組患者中，男46例，女54例；年齡37～66歲，平均年齡（51.29±3.42）歲；病程為1～3年，平均病程（2.25±0.35）年。兩組患者一般資料對比，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。所有患者對本研究知情并簽署同意書。本研究經牡丹江醫學院附屬紅旗醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 納入與排除標準

納入標準：所有患者均經病理診斷確診為甲狀腺癌，且病理分類為乳頭狀癌[7]；抗甲狀腺球蛋白抗體、抗甲狀腺過氧化物酶自身抗體、抗甲狀腺微粒體抗體等指標異常；年齡≥18歲；臨床資料完整。

排除標準：病情不穩定，存活期＜3個月；在研究前有放射線接觸史者；合并自身免疫缺陷類疾病者；合并甲狀腺功能亢進者；合并其他惡性腫瘤者；合并慢性感染類疾病者；合并精神類疾病者。

1.3 方法

一般資料收集：選取牡丹江醫學院附屬紅旗醫院2017年8月～2021年8月收治的100例PCT-HT患者及100例單純甲狀腺乳頭狀癌患者進行回顧性分析，收集所有患者一般臨床資料，其中包括患者的性別、病程、年齡、腫瘤直徑、淋巴結轉移情況、腫瘤侵犯性（甲狀腺腺外侵襲、包膜侵襲性或無侵襲）、臨床分期等。

CK19及Galectin-3表達檢測：應用免疫組化法檢測CK19及Galectin-3表達。具體方法為：所有標本均采取石蠟進行常規包埋，并進行連續切片，厚度為4 μm，在60 ℃下烘烤90 min。隨后應用EnVision法進行實驗，實驗依照試劑盒說明書進行，取2 mL肝素進行抗凝血處理，隨后加入磷酸緩沖鹽溶液（PBS）進行稀釋，直到液體為4 mL位置，隨后加入淋巴分離液2 mL，以2 000 r/min的速度進行20 min離心后吸取單個細胞核。并注意需要在PBS洗滌之后將細胞與抗體異硫氰酸熒光素進行孵育30 min，再次應用PBS洗滌放置到PBS懸浮液之中，應用流式細胞儀觀測其實際情況，應用PBS代替檢測過程中的一抗作為主要的陰性對照分析樣本，并應用已知患者的陽性甲狀腺組織作為免疫組化的陽性對照組織，從而分析不同組織中CK19及Galectin-3的表達水平。應用顯微鏡觀察所有受檢患者甲狀腺組織的實際切片染色情況，將顯微鏡視野調整為400倍后進行觀察，并依照組織所表現的染色強度和染色細胞比例對CK19及Galectin-3的表達水平進行綜合評價。其中，無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。并在顯微鏡下觀察甲狀腺組織切片染色情況，以400倍視野，根據染色強度和染色陽性細胞進行綜合評分。染色強度評分：棕褐色為3分，棕黃色為2分。染色陽性細胞數＞75%為5分，50%～75%為5分，25%～50%為2分，5%～25%為1分，＜5%為0分。最終，根據患者甲狀腺組織的細胞數量和染色實際強度來判斷CK19及Galectin-3表達是否為陽性。0～1分為陰性（-），2～4分為弱陽性（+），5～8分為陽性（++），9～12分為強陽性（+++）[8]。弱陽性（+）、陽性（++）、強陽性（+++）均為陽性。

1.4 統計學分析

采用SPSS 23.0統計學軟件進行數據分析，計數資料以[n（%）]表示，組間比較行χ2檢驗；計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析；采用Spearman相關分析方法分析CK19及Galectin-3與PCT-HT的相關性；應用ROC曲線評價CK19及Galectin-3對PCT-HT診斷的價值；采用Logistic回歸分析分析上述指標對患者的獨立預測價值；用ImageProPlus軟件分析免疫組化結果。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者臨床特征與CK19及Galectin-3表達水平對比

兩組患者性別、年齡、腫瘤直徑、淋巴結轉移情況對比，差異無統計學意義（P＞0.05），兩組患者腫瘤侵犯性、臨床分期、CK19與Galectin-3表達情況對比，差異有統計學意義（P＜0.05），觀察組腫瘤侵犯性為無的占比明顯低于對照組，臨床分期I～II的占比明顯低于對照組，CK19與Galectin-3陽性占比明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。HE和SP法染色顯示，兩組CK19與Galectin-3表達均為陽性，對照組表達稍微高一些。見圖1。

圖1 兩組HE染色及免疫組織化學染色結果

表1 兩組患者臨床特征與CK19及Galectin-3表達水平對比（[-x±s）/n（%）]

2.2 CK19及Galectin-3與PCT-HT的相關性

Spearman相 關 分 析 結 果 顯 示CK19及Galectin-3與PCT-HT呈正相關（r=0.423、0.539，P＜0.05）。見表2。

表2 CK19及Galectin-3與PCT-HT的相關性

2.3 CK19及Galectin-3對PCT-HT的診斷價值

CK19診斷PCT-HT價值曲線下面積為89.63，最佳診斷著色界限值為75.73%，Galectin-3的曲線下面積為78.89，最佳色界限值為82.53%。logistic回歸分析結果表明CK19及Galectin-3對PCT-HT具有獨立預測價值（P＜0.05）。見圖2、表3。

圖2 CK19及Galectin-3對PCT-HT的ROC曲線圖

表3 CK19及Galectin-3對PCT-HT的診斷價值

3 討論

近年來研究發現[9-10]，PCT與HT存在著密切關系，PCTHT發病率呈上升趨勢，HT罹患甲狀腺癌的概率較正常人增加2倍，并且合并HT的患者較未合并者發病風險增高。PCT的癌細胞一般呈現出濾泡狀或乳頭狀排列狀態，并且乳頭的軸心會出現淋巴細胞浸潤現象，而且癌細胞和病變的HT組織相互混合在一起，癌細胞以點狀的散播樣式分布在甲狀腺組織和HT組織中。HT發病后患者的甲狀腺組織呈腫大狀態，且對稱分布，被膜表面比較光滑，輕微增厚，質地韌性較大，與周圍組織無粘連現象。有學者認為[11]，HT的發生會促使甲狀腺乳頭狀癌發展，也是癌前病變的一種，CK19出現異常高表達或BRAF突變可能對于HT癌變產生一定作用。另外有研究認為[12]，甲狀腺乳頭狀癌誘導的癌周淋巴細胞浸潤可能誘導HT的發生。因此，應用有效的分子生物學法輔助診斷PCT-HT具有重要價值。CK19屬于低分子量細胞角蛋白，在各種腫瘤和上皮組織中呈現高表達狀態。有研究發現[13]，CK19在甲狀腺乳頭狀癌中呈現彌漫高表達現象。Galectin-3屬于β-半乳糖苷與蛋白動物凝集素結合的家族成員之一。研究發現[14-15]，Galectin-3在胃癌、乳腺癌、喉癌、膀胱癌、甲狀腺乳頭狀癌等癌癥均存在高表達。因此，本研究對CK19、Galectin-3在PCT-HT的表達和臨床意義展開分析，希望能夠為PCT-HT的診斷提供參考價值。

本研究結果表明，兩組患者腫瘤侵犯性、臨床分期、CK19與Galectin-3表達情況對比差異顯著，觀察組腫瘤侵犯性為無的占比明顯低于對照組，臨床分期I～II的占比明顯低于對照組，CK19與Galectin-3陽性占比明顯高于對照組。由此證明，PCT-HT患者的腫瘤侵犯程度較為嚴重，且CK19與Galectin-3表達水平更高。這可能是因為，HT會通過濾泡上皮細胞過度增生，逐漸轉變為非典型增生，最終發展為PCT。不過，與以往的研究有出入，可能與樣本量的差異性有關。另外，在PCT中Galectin-3和CK19的表達意義已從大量研究中得以印證，兩者聯合應用可提高PCT臨床診斷的敏感度；但這兩種抗體在橋本氏甲狀腺炎合并有甲狀腺乳頭狀癌（PCT）核樣不典型細胞的情況時，同樣呈陽性表達，這使得兩者在臨床工作中更加難以診斷。本研究顯示PCT-HT的發生與濾泡上皮細胞非典型增生具有明顯相關性，也可能是PCT的早期事件[16]；Spearman相關分析結果顯示CK19及Galectin-3與PCT-HT呈正相關（r=0.423、0.539，P＜0.05）。由此證明，PCT-HT患者組織內CK19及Galectin-3呈現更高的表達狀態。這可能是因為，Galectin-3能夠調節細胞分化與生長，抑制腫瘤細胞凋亡，促進血管生成，進而促進腫瘤細胞轉移和侵襲等[17]。研究發現[18-19]，CK-19在PCT總的診斷敏感度較高，對于甲狀腺腫瘤的診斷準確率為22.6%，結節性甲狀腺腫瘤為21.1%，HT為33.3%，PCT為98.5%。因此，CK19與PCT-HT的相關性更高；CK19診斷PCT-HT價值曲線下面積為89.63，最佳診斷著色界限值為75.73%，Galectin-3的曲線下面積為78.89，最佳色界限值為82.53%。由此證明，CK19與Galectin-3在PCT-HT患者中具有較高的診斷價值。黃力營等[20]研究發現，Galectin-3和CK19在診斷甲狀腺乳頭狀微小癌和非典型濾泡上皮增生中具有重要價值，診斷準確率較高，與本研究結果相似。

綜上所述，PCT-HT患者腫瘤侵犯性、臨床分期較高，CK19與Galectin-3陽性表達占比較高，并且CK19免疫組化著色面積＞75.73%，Galectin-3＞82.53%是PCT-HT的相關危險因素。