龍眼葉乙醇提取物在大鼠體內的代謝產物初步研究Δ

胡玨，黃光強，梁潔，3，4#，柳賢福，曹玉嬪，，陳奎奎，李耀華，2，安施佳，梁晶春（.廣西中醫藥大學藥學院，南寧 30200；2.廣西高校中藥提取純化與質量分析實驗室，南寧 30200；3.中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心華南分中心，南寧 30200；4.廣西壯瑤藥工程技術研究中心，南寧 30200；.廣西中醫藥大學賽恩斯新醫藥學院，南寧 30222）

龍眼葉是無患子科龍眼屬植物龍眼Dimocarpus longan Lour.的葉或嫩芽，味甘淡、性平，具有發表清熱、解毒、燥濕等功效，主要用于治療發熱、濕疹、腸炎等[1]。在廣西崇左和賀州等地，龍眼葉一直被作為民間中草藥使用，常以單方形式用于治療糖尿病。本課題組前期已經對龍眼葉不同極性部位的藥理活性進行了篩選，發現龍眼葉乙醇提取物具有一定的降血糖作用[2]。此外，本課題組前期對龍眼葉的血清藥物化學進行了研究，在大鼠血清樣品中發現了槲皮素和木犀草素等原型成分[3]，但未對給藥后的動物尿液及糞便樣品進行分析。為了更加系統地對龍眼葉乙醇活性部位進入到體內的代謝情況進行分析，本研究利用超高效液相色譜-串聯四極桿飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技術，對大鼠給予龍眼葉乙醇提取物后尿液及糞便樣品進行檢測，分析其原型成分及可能的代謝產物，并為進一步闡明龍眼葉降血糖的作用機制提供科學依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有：ACQUITY UPLCⅠ-Class型UPLC儀、Xevo G2-Q-TOF四極桿飛行時間質譜儀（美國Waters公司），SQP型萬分之一電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]，Milli-Q synergy型超純水儀（美國Millipore公司），CT15RE型高速冷凍離心機（日立工機株式會社），ND100-1型氮氣吹掃儀（上海析維醫療科技有限公司）。

1.2 主要藥材與試劑

龍眼葉藥材于2019年11月采自廣西賀州，經廣西中醫藥大學藥學院滕建北教授鑒定為無患子科植物龍眼D.longan Lour.的葉；山柰酚對照品、木犀草素對照品、槲皮素對照品（批號分別為RP200312、RP190505、RP200917，純度均不低于98%）均購自成都麥德生科技有限公司；甲醇、乙腈、甲酸為質譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動物

本研究所用動物為健康清潔級Wistar大鼠，共6只，雄性，體質量為（200±20）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產合格證號為SCXK（湘）2019-0004。將大鼠飼養于溫度（23±2）℃、相對濕度（55±10）%的動物房中，飼養期間自由飲水、進食。本動物實驗方案經廣西中醫藥大學倫理委員會批準（批準號為20220110-035）。

2 方法

2.1 龍眼葉乙醇提取物與混合對照品溶液的制備

2.1.1 龍眼葉乙醇提取物的制備 取龍眼葉粗粉1 500 g，依次加6倍量（mL/g）95%乙醇和50%乙醇加熱回流提取，每次2 h，合并濾液。回收乙醇后，將提取液干燥濃縮至無醇味，即得乙醇提取物浸膏（得膏率約為15%），于4℃下保存，備用。臨用時，用甲醇溶解，過0.22 μm微孔濾膜，取上清液進樣分析。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 取山柰酚、木犀草素、槲皮素對照品各適量，置于同一10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得。

2.2 動物分組與給藥

將大鼠適應性飼養1周后，按體質量隨機分為2組：龍眼葉乙醇提取物給藥組（后文簡稱“給藥組”）和空白對照組，每組3只。給藥組大鼠在實驗前禁食不禁水12 h，然后灌胃龍眼葉乙醇提取物33.8 g/kg（以提取物計，1/3最大耐受劑量），每天2次，連續給藥3 d[4]；空白對照組大鼠同步灌胃等體積生理鹽水。

2.3 糞便和尿液樣品采集與處理

分別收集給藥后0～72 h的大鼠糞便和給藥后0～48 h的大鼠尿液，每12 h收集1次。將糞便樣品在50℃下烘干，碾碎。將尿液樣品以2 500 r/min離心5 min后取上清液。隨后將糞便和尿液樣品置于-80℃下保存，備用。

2.4 糞便和尿液供試品溶液的制備

2.4.1 糞便供試品溶液的制備 將各時間段的糞便樣品混合均勻后，取0.3 g糞便粉末，加入1.5 mL甲醇，渦旋振蕩2 min，超聲（功率250 W，頻率50 kHz）提取30 min后，在4℃下以13 000 r/min離心10 min（下同），取上清液，過0.22μm微孔濾膜，收集濾液，即為糞便供試品溶液。

2.4.2 尿液供試品溶液的制備 取各時間段尿液樣品混合均勻，在37℃下吹氮氣濃縮至2 mL。加2 mL甲醇沉淀蛋白，離心，取1 mL上清液吹干，加400 μL 0.1%甲酸-乙腈溶液復溶后，離心，取上清液，過0.22μm微孔濾膜，收集濾液，即為尿液供試品溶液。

2.5 色譜與質譜條件

2.5.1 色譜條件 采用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），以乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～8 min，10%A→55%A；8～12 min，55%A→63%A；12～14 min，63%A→67%A；14～16 min，67%A→70%A；16～17 min，70%A→80%A；17～18 min，80%A→90%A；18～18.5 min，90%A→100%A；18.5～19 min，100%A→10%A；19～20 min，10%A）；流速為0.3 mL/min；柱溫為35 ℃；進樣量為4 μL。

2.5.2 質譜條件 采用電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），選擇正離子模式進行檢測，離子源溫度為140℃；毛細管電壓為3.0 kV，錐孔電壓為40 V；脫溶劑電壓為80 V，脫溶劑氣溫度為400℃，脫溶劑氣流量為800 L/h；錐孔氣流量為50 L/h；掃描范圍為質荷比（m/z）50～1 200。

2.6 樣品分析

取龍眼葉乙醇提取物、糞便供試品溶液、尿液供試品溶液，分別按“2.5”項下色譜與質譜條件進樣檢測。采用Masslynx v4.1數據處理軟件對實驗數據進行分析，得到化合物的精確相對分子量、分子式及碎片信息。利用得到的目標化合物的一級、二級碎片離子信息與儀器自帶的數據庫及譜庫進行匹配，并通過與對照品圖譜和國內外相關文獻資料進行比對，對化合物進行推測和鑒定。

3 結果

3.1 龍眼葉乙醇提取物在大鼠體內的主要代謝產物分析

在正離子檢測模式下獲得的各樣品的基峰色譜圖見圖1。結果顯示，從大鼠糞便和尿液樣品中共鑒定出8個化合物。通過將龍眼葉乙醇提取物色譜圖與給藥組、空白對照組大鼠糞便和尿液樣品色譜圖進行比對，共發現2個原型成分（峰1、2），其余6個為代謝產物（峰M1～M6）。通過進一步比較空白對照組和給藥組大鼠糞便和尿液樣品的色譜圖，從給藥組大鼠糞便樣品中初步鑒定出了3個化合物（包括2個原型成分和1個代謝產物），從大鼠尿液樣品中初步鑒定出了5個化合物（均為代謝產物），結果見表1。

圖1 正離子模式下各樣品的基峰色譜圖

表1 龍眼葉乙醇提取物在大鼠體內的主要代謝產物分析結果

3.2 龍眼葉乙醇提取物中原型成分的鑒定

3.2.1 峰1的鑒定 龍眼葉乙醇提取物質譜圖中峰1的保留時間為4.13 min，由一級質譜圖得到其準分子離子峰為m/z 303.050 4[M+H]+，分子式為C15H11O7。二級質譜圖中存在m/z 229.049 7和m/z 153.019 0的特征碎片離子。其中m/z 153.019 0的特征碎片離子與槲皮素對照品一致。對比空白對照組大鼠糞便樣品質譜圖發現，給藥組大鼠糞便樣品質譜圖中峰1的保留時間為4.17 min，且由一級質譜圖得到其準分子離子峰為m/z 303.050 5[M+H]+，由此推測龍眼葉乙醇提取物中的峰1是以原型成分進入到大鼠糞便之中。根據文獻[5-6]報道的質譜信息，推測峰1為槲皮素。龍眼葉乙醇提取物中峰1和槲皮素對照品的二級質譜圖見圖2。

圖2 龍眼葉乙醇提取物中峰 11和槲皮素對照品的二級質譜圖

3.2.2 峰2的鑒定 龍眼葉乙醇提取物中峰2的保留時間為4.64 min，準分子離子峰為m/z 287.055 8[M+H]+，分子式為C15H11O6，二級質譜圖中存在m/z 213.055 4和m/z 153.019 3的特征碎片離子，推測其可能為木犀草素或山柰酚[5，7]。同時，對比空白對照組大鼠糞便樣品發現，給藥組大鼠糞便樣品中峰2的保留時間為4.68 min，準分子離子峰為m/z 287.055 5[M+H]+，由此推測龍眼葉乙醇提取物中峰2是以原型成分進入到大鼠糞便之中。其中，龍眼葉乙醇提取物中峰2的碎片離子m/z 153.019 3是黃酮類化合物發生逆狄爾斯-阿德爾反應（Retro Diels-Alder reaction，RDA）裂解所產生的特征碎片離子，與木犀草素對照品一致，再結合峰2的出峰時間，推測峰2為木犀草素。龍眼葉乙醇提取物中峰2和木犀草素對照品的二級質譜圖見圖3。

圖3 龍眼葉乙醇提取物中峰 22和木犀草素對照品的二級質譜圖

3.3 尿液和糞便樣品中代謝產物的鑒定

3.3.1 峰M1的鑒定 給藥組大鼠尿液樣品中峰M1的保留時間為3.11 min，準分子離子峰為m/z 431.090 7[M+H]+，分子式為C21H19O10。二級質譜圖中存在m/z255.0658、m/z 199.074 5和m/z 149.022 2的碎片離子。其裂解過程為準分子離子峰m/z 431.090 7[M+H]+失去1個C6H8O6碎片離子，得到m/z 255.065 8的碎片離子，推測該化合物可能存在葡萄糖醛酸化過程。隨后此碎片離子繼續裂解，先后失去1個CO中性分子，產生m/z 199.074 5的碎片離子。二級碎片離子m/z 255.065 8與木犀草素或山柰酚的準分子離子峰的分子量相差32，提示m/z 255.065 8的碎片離子可能為木犀草素或山柰酚的脫氧產物。結合文獻[8]報道的質譜信息，初步推測峰M1為木犀草素或山柰酚脫氧后與葡萄糖醛酸的結合產物，其在大鼠體內的可能代謝途徑見圖4。

3.3.2 峰M2的鑒定 給藥組大鼠尿液樣品中峰M2的保留時間為4.38 min，準分子離子峰為m/z 493.099 0[M+H]+，分子式為C22H21O13。二級質譜圖中存在m/z403.1300、m/z 317.066 9、m/z 220.139 2和m/z 182.774 5的碎片離子，其中m/z 317.066 9的豐度較高，由此推測該化合物可能含有槲皮素甲基化的母核。進一步對準分子離子峰進行分析，發現準分子離子峰m/z 493.099 0[M+H]+比碎片離子m/z 317.066 9的分子量多了176，提示該化合物可能存在葡萄糖醛酸化代謝過程，由此推測該化合物可能是槲皮素先發生甲基化后再與葡萄糖醛酸結合形成的代謝產物。結合文獻[9]報道的質譜信息，推測峰M2為槲皮素甲基化后葡萄糖醛酸化產物，其可能的代謝途徑見圖4。

圖4 龍眼葉乙醇提取物在大鼠體內的可能代謝途徑

3.3.3 峰M3的鑒定 給藥組大鼠尿液樣品中峰M3的保留時間為5.34 min，準分子離子峰為m/z 255.066 2[M+H]+，分子式為C15H11O4。二級質譜圖中存在m/z 227.071 0、m/z 199.075 7、m/z 181.065 9、m/z 137.024 4 和 m/z 133.028 9的碎片離子。其裂解過程為準分子離子峰m/z 255.066 2[M+H]+先后失去1個CO中性分子后，分別得到m/z 227.071 0與m/z 199.075 7的碎片離子。m/z 199.075 7碎片離子繼續裂解，失去1個中性H2O分子，產生m/z 181.065 9的碎片離子，后者再失去1個中性CO2分子，產生m/z 137.024 4的碎片離子。此外，還存在m/z 133.028 9的碎片離子，這是黃酮類成分發生RDA裂解所產生的特征碎片離子。同時，該化合物的準分子離子峰m/z 255.066 2比木犀草素或山柰酚準分子離子峰的分子量少了32，推測其可能為木犀草素或山柰酚脫氧后的代謝產物。結合文獻[8]報道的質譜信息，推測峰M3為木犀草素或山柰酚的脫氧產物，其可能的代謝途徑見圖4。

3.3.4 峰M4的鑒定 給藥組大鼠糞便樣品中峰M4的保留時間為5.67 min，準分子離子峰為m/z 303.050 5[M+H]+，分子式為C15H11O7。二級質譜圖中存在m/z 285.042 5、m/z 257.045 3、m/z 229.050 3、m/z 201.056 0、m/z 173.059 4、m/z 165.019 1、m/z 153.018 6和m/z 137.024 5的碎片離子，這與文獻[6]報道的槲皮素二級質譜裂解信息基本一致，由此推測其可能為槲皮素。同時，該化合物的準分子離子峰m/z 303.050 5[M+H]+比木犀草素準分子離子峰m/z 287.055 8[M+H]+的分子量大16，結合文獻[10]報道的質譜信息，推測峰M4也可能為木犀草素的氧化產物。再結合化合物的出峰時間，推測峰M4為木犀草素的氧化產物，其可能的代謝途徑見圖4。

3.3.5 峰M5的鑒定 給藥組大鼠尿液樣品中峰M5的保留時間為6.50 min，準分子離子峰為m/z 271.060 8[M+H]+，分子式為C15H11O5。二級質譜圖中存在m/z 243.065 8、m/z 215.070 8、m/z 197.061 9、m/z 169.062 4、m/z 153.018 9和m/z 149.024 7的碎片離子。其裂解過程為準分子離子峰先后失去1個CO中性分子，分別得到m/z 243.065 8與m/z 215.070 8的碎片離子。m/z 215.070 8碎片離子可繼續裂解，失去1個中性H2O分子，產生m/z 197.061 9的碎片離子。m/z 197.061 9碎片離子繼續裂解，失去1個中性CO分子，產生m/z 169.062 4的碎片離子。此外，還存在m/z 153.018 9的碎片離子，這是黃酮類成分發生RDA裂解所產生的特征碎片離子。同時，該化合物的準分離子峰m/z 271.060 8[M+H]+比槲皮素準分子離子峰m/z 303.050 4[M+H]+的分子量小32，提示其可能為槲皮素脫氧后的代謝產物。進一步結合文獻[11]報道的質譜信息，推測峰M5為槲皮素脫氧后的代謝產物，其可能的代謝途徑見圖4。

3.3.6 峰M6的鑒定 給藥組大鼠尿液樣品中峰M6的保留時間為6.79 min，由一級質譜圖得到其準分子離子峰為m/z 317.066 4[M+H]+，分子式為C16H13O7。二級質譜圖中存在m/z 302.041 3、m/z 285.039 9、m/z 274.044 5、m/z 229.047 1、m/z 201.057 1、m/z 165.020 9、m/z 153.019 5和m/z 139.041 5的碎片離子。由文獻報道可知，m/z 285.039 9、m/z 229.047 1、m/z 201.057 1、m/z 165.020 9和m/z 153.019 5是槲皮素的特征碎片離子[6]，由此推測該化合物結構中存在槲皮素的母核。同時，該化合物的準分子離子峰m/z 317.066 4[M+H]+比槲皮素準分子離子峰m/z 303.050 4[M+H]+的分子量大14，推測其可能為槲皮素與甲基結合后得到的代謝產物。進一步結合文獻[9]報道的質譜信息，推測M6為槲皮素甲基化產物，其可能的代謝途徑見圖4。

4 討論

通過與空白對照組大鼠尿液和糞便樣品的基峰色譜圖比對，在給藥組大鼠糞便樣品中發現了槲皮素和木犀草素的原型成分，這與本課題組的前期研究結果基本一致[12]。但是在本研究中，槲皮苷與沒食子酸乙酯在大鼠代謝產物中未被檢出，這可能是因為其含量太低無法檢測到或代謝較慢未能收集到。初步鑒定出的化合物多為槲皮素和木犀草素的代謝產物，其代謝路徑主要包括甲基化、葡萄糖醛酸化和氧化過程，與文獻[13-14]報道的代謝途徑一致。黃酮類化合物廣泛存在于中藥中，其在治療糖尿病、阿爾茨海默病和抗氧化、降血脂、抗炎等方面都具有一定功效[15-17]。如槲皮素可以通過抑制胰島細胞凋亡以及降低機體氧化應激水平來降血糖，木犀草素也具有一定的降糖活性[18-19]。本研究結果表明，龍眼葉乙醇提取物中槲皮素和木犀草素參與了大鼠體內代謝，這在一定程度上說明了龍眼葉中的黃酮類成分可能是其發揮降血糖作用的藥效物質。

在本研究中，給藥組大鼠糞便樣品中的化學成分多以原型成分存在，尿液樣品中的化學成分多以代謝產物的形式存在，筆者推測這可能是由于龍眼葉乙醇提取物在大鼠糞便中代謝較慢或藥物濃度較高，導致許多化學成分還沒有進行徹底代謝就隨糞便排泄到體外。此外，本研究在給藥組大鼠糞便樣品的基峰色譜圖中發現了準分子離子峰為m/z 520.340 8[M+H]+、m/z 522.355 9[M+H]+的化合物（峰3、4），經與龍眼葉乙醇提取物比對，確定其為原型成分；同時，筆者還發現了只有在給藥組大鼠糞便樣品中才存在的代謝產物（如峰M7、M8）。但由于文獻資料的限制，僅從已知的一級質譜和二級質譜信息暫時未能對這些化合物的結構進行鑒定，這些化合物的碎片信息還需要在后期研究中進一步分析。

綜上，本研究利用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術對龍眼葉乙醇提取物在大鼠體內的代謝產物進行了初步研究，發現龍眼葉乙醇提取物灌胃后在大鼠體內主要經甲基化、葡萄糖醛酸化等途徑代謝，為尋找龍眼葉降血糖的可能代謝途徑提供了一定的參考。但是，還有部分原型成分及代謝產物無法進行鑒定，為了明確其化合物的具體結構，后期還需結合多級質譜信息及對照品比對，對分離出的化合物進一步分析鑒定，以便對龍眼葉降血糖的代謝途徑進行更為全面的分析。