人參-茯苓藥對(duì)抗衰老活性條件篩選及機(jī)制研究Δ

白竹林，趙大慶，陳靜靜，曾婧，白雪媛，王思明（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，長(zhǎng)春 130117）

衰老是生物體正常的生理過程，其受體內(nèi)外多種因素（環(huán)境因素、心理因素、遺傳因素等）的影響，涉及全身多個(gè)器官和系統(tǒng)。根據(jù)2020年全國(guó)人口普查結(jié)果，中國(guó)60歲及以上老人有26 402萬(wàn)人，占總?cè)丝诘?8.70%，比十年前的數(shù)據(jù)增加了5.44%[1]，提示中國(guó)人口老齡化進(jìn)程進(jìn)一步深化。隨著老齡化問題的日益嚴(yán)重，越來(lái)越多的學(xué)者開始關(guān)注抗衰老研究。

目前，用于研究衰老的模型十分廣泛，從簡(jiǎn)單的單細(xì)胞生物到復(fù)雜的哺乳動(dòng)物均有所應(yīng)用，如釀酒酵母、線蟲、果蠅、鼠等[2]。釀酒酵母是抗衰老研究中最簡(jiǎn)單的生物模型，其衰老代謝反應(yīng)機(jī)制與人體細(xì)胞非常相似[3]，生長(zhǎng)周期短且易于培養(yǎng)，可進(jìn)行高通量藥物活性篩選[4]。基于上述優(yōu)點(diǎn)，釀酒酵母已被廣泛用作研究衰老的模式生物。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，衰老是指隨著年齡的增長(zhǎng)，人體陽(yáng)氣下降，氣血不足，內(nèi)臟功能下降，氣血陰陽(yáng)失衡。中醫(yī)衰老學(xué)說(shuō)包括腎虛衰老說(shuō)、脾胃虛弱衰老說(shuō)、氣虛血瘀衰老說(shuō)等[5]。根據(jù)中醫(yī)古籍記載，人參-茯苓藥對(duì)是一種常用的配伍組合，在古代抗衰老方劑中，人參和茯苓配伍的比例排在第1位，二者配伍組合出現(xiàn)了146次[6—7]。《神農(nóng)本草經(jīng)》記載“人參主補(bǔ)五臟，久服輕身延年”[8]。研究表明，茯苓具有安魂、養(yǎng)神、延年的作用[9]。目前關(guān)于人參、茯苓二者配伍抗衰老的相關(guān)研究較少，且作用機(jī)制尚不明確。基于此，本研究以釀酒酵母為衰老模型生物，篩選人參-茯苓藥對(duì)抗衰老的最佳配伍比例、給藥濃度和給藥時(shí)間點(diǎn)，通過測(cè)定抗氧化酶活性，活性氧（reactive oxygen species，ROS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平，三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）含量和線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP），以及氧化應(yīng)激與能量代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平，初探人參-茯苓藥對(duì)抗衰老作用機(jī)制，以期為人參-茯苓藥對(duì)治療由衰老導(dǎo)致的疾病提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有innova40型全溫振蕩培養(yǎng)箱、Eppendorf AG型高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），AB135-S型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司），infinite M200PRO型酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司），SCIENTZ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），CFX型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）儀（美國(guó)Bio Rad公司）。

1.2 主要藥品與試劑

人參、茯苓購(gòu)自吉林省長(zhǎng)春市宏檢大藥房（批號(hào)分別為20210326、20210415），經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室王哲副教授鑒定為真品；磷酸鹽緩沖液（PBS）購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司（批號(hào)AC10257442）；YPD液體培養(yǎng)基、MTT、卡那霉素、酵母破壁酶、過氧化氫酶（catalase，CAT）檢測(cè)試劑盒、過氧化物酶（peroxidase，POD）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司（批號(hào)分別為626J031、1015D052、325P0414、20201130、20210924、20211009）；BCA蛋白定量試劑盒、ROS檢測(cè)試劑盒、MDA檢測(cè)試劑盒、MMP檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)分別為070721211011、061821211119、073120201113、020421210406）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒、ATP含量檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所（批號(hào)分別為20210830、20190708）；總RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司（批號(hào)W9113）；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB Green?Premix Ex TaqTM試劑盒均購(gòu)自日本Takara公司（批號(hào)分別為AK71647A、AJG1875A）；目標(biāo)基因TUB1、SOD1、CTT1、GSH1、ATP1、MRS1、CDC19由長(zhǎng)春庫(kù)美生物科技有限公司合成，引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。

表1 PCR引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.3 菌種

本研究所用釀酒酵母BY4742購(gòu)自武漢淼靈生物科技有限公司。

2 方法

2.1 人參-茯苓藥對(duì)提取物的制備

筆者查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，人參、茯苓在臨床上的常用配伍比例為1∶1、1∶2和1∶4（m/m，下同）[10-11]，故本研究設(shè)置人參、茯苓的配伍比例為1∶1、1∶2、2∶1、1∶4、4∶1。將人參、茯苓分別粉碎過60目篩后，按1∶1、1∶2、2∶1、1∶4、4∶1混勻備用，每份50 g。取混勻后的藥材粉末加10倍量水（mL/g，下同）煎煮2 h，過濾；濾渣加8倍量水煎煮1.5 h，過濾；合并2次濾液，以5 000 r/min離心10 min，取上清液，濃縮，烘干，即得不同配伍比例的人參-茯苓藥對(duì)提取物（得率分別為14.83%、11.03%、16.07%、7.74%、22.06%）。另外，同法制備人參、茯苓單味藥材提取物，得率分別為28.36%、2.46%。

2.2 釀酒酵母的培養(yǎng)及生長(zhǎng)曲線繪制

將釀酒酵母以平板劃線方式在YPD固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，于28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h活化。取活化后的單菌落置于5 mL YPD液體培養(yǎng)基中（培養(yǎng)基中加入50 mg/mL卡那霉素5 μL），于28 ℃、180 r/min培養(yǎng)箱中擴(kuò)大培養(yǎng)，再進(jìn)行二次擴(kuò)大培養(yǎng)，使接種量為2%[12]。取經(jīng)二次擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌液，以2%的接種量接種于新的培養(yǎng)基中，置于28℃、180 r/min培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并將此時(shí)記為0 h（初始接種期），每隔4 h取樣。孔板中加入不同培養(yǎng)時(shí)間的釀酒酵母菌液30 μL，再加420 μL培養(yǎng)基，采用MTT法于600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品吸光度值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸光度值×稀釋倍數(shù)為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線，以確認(rèn)釀酒酵母進(jìn)入衰老期的時(shí)間點(diǎn)。

2.3 人參-茯苓藥對(duì)最佳配伍比例和給藥條件的篩選

2.3.1 最佳配伍比例的篩選 筆者參考文獻(xiàn)[13]方法，先將不同配伍比例的人參-茯苓藥對(duì)提取物的給藥濃度設(shè)置為180 μg/mL，給藥時(shí)間點(diǎn)設(shè)置為第16 h。取“2.2”項(xiàng)下經(jīng)二次擴(kuò)大培養(yǎng)的釀酒酵母菌液，按2%的接種量接種于新的培養(yǎng)基中（此時(shí)開始計(jì)時(shí)，下同），培養(yǎng)至第16 h時(shí)，分為空白對(duì)照組和不同配伍比例（1∶1、1∶2、2∶1、1∶4、4∶1）的人參-茯苓藥對(duì)提取物組，空白對(duì)照組加入等體積無(wú)菌水，給藥組分別加入180 μg/mL不同配伍比例的人參-茯苓藥對(duì)提取物，繼續(xù)培養(yǎng)至第96 h，取樣；采用MTT法測(cè)定細(xì)胞吸光度值（吸光度值越大，表明細(xì)胞存活率越高），以篩選最佳配伍比例。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3.2 最佳給藥濃度的篩選 參考文獻(xiàn)[14]方法，將給藥時(shí)間點(diǎn)設(shè)置為第16 h，人參-茯苓藥對(duì)1∶4提取物（根據(jù)“2.3.1”項(xiàng)下結(jié)果確定）的給藥濃度設(shè)置為100、140、180、220、260、300 μg/mL。取“2.2”項(xiàng)下經(jīng)二次擴(kuò)大培養(yǎng)的釀酒酵母菌液，按2%的接種量接種于新的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至第16 h時(shí)，分為空白對(duì)照組和人參-茯苓藥對(duì)1∶4提取物不同給藥濃度組，空白對(duì)照組加入等體積無(wú)菌水，給藥組分別加入不同濃度的人參-茯苓藥對(duì)1∶4提取物，繼續(xù)培養(yǎng)至第96 h，取樣；采用MTT法測(cè)定細(xì)胞吸光度值，以篩選最佳給藥濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3.3 最佳給藥時(shí)間點(diǎn)的篩選 選擇“2.3.1”“2.3.2”項(xiàng)下篩選出的最佳配伍比例和給藥濃度，將給藥時(shí)間點(diǎn)設(shè)置為第16、22、28、34、40、46、52、58、64、70、76、82、88 h。取“2.2”項(xiàng)下經(jīng)二次擴(kuò)大培養(yǎng)的釀酒酵母菌液，按2%的接種量接種于新的培養(yǎng)基中，分為空白對(duì)照組和不同給藥時(shí)間點(diǎn)組，然后分別培養(yǎng)至上述時(shí)間點(diǎn)時(shí)給藥，繼續(xù)培養(yǎng)至第96 h，取樣；采用MTT法測(cè)定細(xì)胞吸光度值，以篩選最佳給藥時(shí)間點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性及ROS、MDA水平的測(cè)定

2.4.1 分組及給藥 取“2.2”項(xiàng)下經(jīng)二次擴(kuò)大培養(yǎng)的釀酒酵母菌液，按2%的接種量接種于新的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至第28 h時(shí)，分為空白對(duì)照組、人參-茯苓藥對(duì)1∶4提取物組（220 μg/mL）、人參單藥組（220 μg/mL）、茯苓單藥組（220 μg/mL）。空白對(duì)照組加入等體積無(wú)菌水，各給藥組分別加入相應(yīng)藥物，繼續(xù)培養(yǎng)至第96 h后，取樣進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4.2 粗酶液的制備 取“2.4.1”項(xiàng)下各組釀酒酵母菌液500 μL，以3 000 r/min離心5 min，吸棄培養(yǎng)基；沉淀用PBS洗滌3次后，加入500 μL PBS，置于冰水浴中超聲（功率300 W，工作9 s，間歇3 s，總時(shí)間為5 min）破碎，然后于4℃條件下以12 000 r/min離心10 min，取上清液（即粗酶液），采用BCA法測(cè)定蛋白濃度后，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.3 釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)SOD、POD、CAT水平及MDA水平的檢測(cè) 取“2.4.2”項(xiàng)下各組釀酒酵母細(xì)胞粗酶液適量至96孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，按照試劑盒說(shuō)明書方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性及MDA水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4.4 釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)ROS水平的檢測(cè) 取“2.4.1”項(xiàng)下各組釀酒酵母菌液50 μL，以3 000 r/min離心5 min，吸棄培養(yǎng)基；沉淀用PBS洗滌3次后，加入DCFH-DA染色液500 μL，置于28℃培養(yǎng)箱中孵育30 min。離心棄去染色液，以PBS洗滌細(xì)胞3次后，用500 μL PBS重懸，取100 μL重懸液加入熒光板中，采用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)ATP含量及MMP的測(cè)定

2.5.1 ATP含量的測(cè)定 取“2.4.1”項(xiàng)下各組釀酒酵母菌液50 μL，以3 000 r/min離心5 min，吸棄培養(yǎng)基；沉淀用PBS洗滌3次后，加入酵母破壁酶，于30℃孵育2 h，再離心除去上清液，沉淀用PBS清洗3次；加入200 μL裂解液渦旋5 s，反復(fù)3次，于4℃條件下以12 000 r/min離心5 min，取上清液按照試劑盒說(shuō)明書方法操作，檢測(cè)ATP含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5.2 MMP的測(cè)定 取“2.4.1”項(xiàng)下各組釀酒酵母菌液50 μL，以3 000 r/min離心5 min，吸棄培養(yǎng)基；沉淀用PBS洗滌3次后，加入2 μmol/L羅丹明123溶液500 μL，于28℃培養(yǎng)箱中避光孵育30 min；離心除去上清液，沉淀用PBS洗滌3次后，加入500 μL PBS重懸，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MMP。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激與能量代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的測(cè)定

取“2.4.1”項(xiàng)下各組釀酒酵母菌液5 mL，用Trizol法提取總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板，進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系（共25 μL）為SYBR 12.5 μL，DEPC水8 μL，cDNA模版2.5 μL，上、下游引物各1 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。以TUB1為內(nèi)參，采用2-△△Ct法定量分析SOD1、CTT1、GSH1、ATP1、MRS1、CDC19 mRNA的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均采用±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 釀酒酵母的生長(zhǎng)曲線

由圖1可知，第0～4 h時(shí)為釀酒酵母的遲滯期，第4～16 h時(shí)為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，16 h以后進(jìn)入穩(wěn)定期，第68 h時(shí)到達(dá)拐點(diǎn)，釀酒酵母開始進(jìn)入衰老期，直至第96 h左右酵母細(xì)胞數(shù)量趨于穩(wěn)定，因此選擇第96 h作為本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)。

圖1 釀酒酵母的生長(zhǎng)曲線

3.2 人參-茯苓藥對(duì)最佳配伍比例和給藥條件

3.2.1 最佳配伍比例 與空白對(duì)照組（0.46±0.02）比較，人參-茯苓藥對(duì)2∶1提取物組（0.58±0.06）和人參-茯苓藥對(duì)1∶4提取物組（0.78±0.03）的吸光度值均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），且后者的吸光度值更大，提示釀酒酵母細(xì)胞的存活率更高。由此可知，人參、茯苓的最佳配伍比例為1∶4。

3.2.2 最佳給藥濃度 與空白對(duì)照組（5.36±0.12）比較，人參-茯苓藥對(duì)1∶4提取物220 μg/mL組（7.61±0.13）和人參-茯苓藥對(duì)1∶4提取物300 μg/mL組（6.52±0.17）的吸光度值均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），且前者的吸光度值更大（即釀酒酵母細(xì)胞的存活率更高）、給藥濃度更小。由此可知，人參-茯苓藥對(duì)1∶4提取物的最佳給藥濃度為220 μg/mL。

3.2.3 最佳給藥時(shí)間點(diǎn) 與空白對(duì)照組（8.22±0.24）比較，第28 h組（10.55±0.08）和第64 h組（8.71±0.06）的吸光度值均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），且前者吸光度值更大，提示釀酒酵母細(xì)胞的存活率更高。由此可知，最佳給藥時(shí)間點(diǎn)為第28 h。

3.3 釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性及MDA、ROS水平

與空白對(duì)照組比較，人參-茯苓藥對(duì)1∶4提取物組釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD、POD、CAT活性均顯著升高（P＜0.01），MDA、ROS水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；人參單藥組釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)POD、CAT活性顯著升高（P＜0.05）；茯苓單藥組釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)SOD、POD、CAT活性均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 各組釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性及MDA、ROS水平的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝3）

表2 各組釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性及MDA、ROS水平的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝3）

a：與空白對(duì)照組比較，P＜0.01；b：與空白對(duì)照組比較，P＜0.05

組別空白對(duì)照組人參-茯苓藥對(duì)1∶4提取物組人參單藥組茯苓單藥組ROS 4155.77±137.73 3553.84±261.97b 3992.93±246.53 4082.47±47.66 SOD/（U/mgprot）63.70±1.42 96.22±1.29a 72.21±2.57 78.83±0.84b POD/（U/mgprot）4.97±0.07 14.09±0.12a 10.21±0.12 13.06±0.08a CAT/（U/mgprot）0.65±0.03 8.12±0.17a 4.38±0.19b 2.97±0.08a MDA/（μmol/mgprot）0.88±0.01 0.50±0.08a 0.55±0.06 0.74±0.03

3.4 釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)ATP含量及MMP水平的測(cè)定結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，人參-茯苓藥對(duì)1∶4提取物組釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)ATP含量及MMP均顯著升高（P＜0.01）；人參單藥組和茯苓單藥組釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)ATP含量顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表3、圖2。

表3 各組釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)ATP含量及MMP的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝3）

表3 各組釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)ATP含量及MMP的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝3）

a：與空白對(duì)照組比較，P＜0.01；b：與空白對(duì)照組比較，P＜0.05

組別空白對(duì)照組人參-茯苓藥對(duì)1∶4提取物組人參單藥組茯苓單藥組ATP/（nmoL/mg）153.41±15.78 863.32±23.59a 746.52±18.13b 689.37±11.19b MMP/Hz 165.98±10.08 367.30±18.90a 223.40±8.87 226.48±9.99

圖2 各組釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)MMP的熒光強(qiáng)度圖

3.5 釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激與能量代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的測(cè)定結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，人參-茯苓藥對(duì)1∶4提取物組釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)SOD1、ATP1、CDC19 mRNA的表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），CTT1、GSH1、MRS1 mRNA的表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）；人參單藥組和茯苓單藥組釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)SOD1（茯苓單藥組除外）、ATP1 mRNA的表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表4。

表4 各組釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激與能量代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝3）

表4 各組釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激與能量代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝3）

a：與空白對(duì)照組比較，P＜0.01；b：與空白對(duì)照組比較，P＜0.05

組別空白對(duì)照組人參-茯苓藥對(duì)1∶4提取物組人參單藥組茯苓單藥組SOD1mRNA 1.00±0.00 0.61±0.01a 0.63±0.01b 0.91±0.02 CTT1mRNA 1.00±0.00 2.50±0.12a 0.97±0.01 1.41±0.39 GSH1mRNA 1.00±0.00 1.71±0.18a 1.40±0.05 1.15±0.09 ATP1mRNA 1.00±0.00 0.31±0.01a 0.37±0.06a 0.68±0.02b MRS1mRNA 1.00±0.00 1.40±0.05a 1.09±0.11 0.82±0.01 CDC19mRNA 1.00±0.00 0.49±0.01b 0.74±0.04 0.95±0.02

4 討論

人參和茯苓均具有抗衰老作用，在古代許多方劑中均有應(yīng)用，且人參-茯苓藥對(duì)是抗衰老最常見的配伍。目前，大多數(shù)學(xué)者研究的是人參或茯苓中某種化學(xué)成分的抗衰老作用，如：人參總皂苷對(duì)果蠅有抗衰老作用；人參皂苷Rg1可在造血干/祖細(xì)胞連續(xù)移植中延緩細(xì)胞衰老；人參皂苷Re可修復(fù)自然衰老大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力；人參多糖可通過抑制ROS表達(dá)延緩細(xì)胞衰老；茯苓多糖可通過清除自由基實(shí)現(xiàn)抗衰老作用；茯苓水提取物可抑制人成纖維細(xì)胞HS68的衰老凋亡；茯苓酸可延緩人肺成纖維細(xì)胞WI-38的衰老，等等[15-21]。基于此，筆者首先對(duì)人參、茯苓的配伍比例進(jìn)行篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)人參、茯苓的質(zhì)量比為1∶4時(shí)，釀酒酵母細(xì)胞的存活率最高；再通過進(jìn)一步篩選，得到人參-茯苓藥對(duì)1∶4提取物的最佳給藥濃度為220 μg/mL、最佳給藥時(shí)間點(diǎn)為第28 h。

相關(guān)研究表明，氧化反應(yīng)可為生命體提供能量，該反應(yīng)過程中產(chǎn)生的ROS越高，則抗氧化能力越弱[22]。因此，ROS的清除對(duì)機(jī)體具有重要作用。清除ROS的過程常需要一系列抗氧化酶的參與，其中就包括SOD、POD和CAT等[23]。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)中的重要標(biāo)志物，可間接反映細(xì)胞遭受自由基損害的嚴(yán)重程度[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)人參-茯苓藥對(duì)1∶4提取物干預(yù)后，釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD、POD、CAT活性均顯著升高，ROS和MDA水平均顯著降低，這表明人參-茯苓藥對(duì)1∶4提取物可緩解釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激程度。

釀酒酵母中的抗氧化活性基因主要有SOD1、CTT1、GSH1等[25]。SOD1基因編碼銅/鋅過氧化物歧化酶，可將氧自由基轉(zhuǎn)化為H2O2，再進(jìn)一步被機(jī)體清除[26]。CTT1基因的高表達(dá)可抵御氧化損傷；谷胱甘肽具有抗氧化作用，GSH1是編碼谷胱甘肽合成酶的基因，對(duì)谷胱甘肽的合成具有重要作用[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)人參-茯苓藥對(duì)1∶4提取物干預(yù)后，釀酒酵母細(xì)胞中CTT1、GSH1 mRNA的表達(dá)水平均顯著升高，SOD1 mRNA的表達(dá)水平顯著降低，這進(jìn)一步說(shuō)明人參-茯苓藥對(duì)1∶4提取物可通過正向調(diào)控氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗衰老的作用。

衰老與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，在衰老過程中伴隨著細(xì)胞凋亡、壞死等。衰老細(xì)胞內(nèi)ATP含量下降，MMP會(huì)隨著細(xì)胞狀態(tài)的改變而發(fā)生改變，MMP的丟失被認(rèn)為是早期凋亡的特征之一[28]。線粒體是能量代謝的主要場(chǎng)所，ATP合酶是線粒體氧化磷酸化的關(guān)鍵酶，其功能缺陷會(huì)導(dǎo)致能量代謝障礙，從而引起細(xì)胞衰老。ATP1基因是調(diào)控ATP酶的α亞基，其水平下調(diào)可以促進(jìn)ATP酶的合成，從而維持細(xì)胞能量代謝穩(wěn)定[29]；CDC19基因可調(diào)控丙酮酸脫氫酶激酶，其水平下調(diào)可以增加ATP的有效循環(huán)，對(duì)能量代謝有正向作用[30]；MRS1是編碼細(xì)胞線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因，其高表達(dá)有利于維持線粒體的正常結(jié)構(gòu)及功能[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)人參-茯苓藥對(duì)1∶4提取物干預(yù)后，釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)ATP1、CDC19 mRNA的表達(dá)水平均顯著降低，ATP含量和MMP以及MRS1 mRNA的表達(dá)水平均顯著升高，這表明人參-茯苓藥對(duì)1∶4提取物對(duì)釀酒酵母細(xì)胞的能量代謝具有正向調(diào)控作用。

綜上所述，人參-茯苓藥對(duì)以1∶4的質(zhì)量比配伍時(shí)對(duì)釀酒酵母的抗衰老作用較好，其作用機(jī)制可能與正向調(diào)控釀酒酵母細(xì)胞氧化應(yīng)激以及能量代謝有關(guān)。