北蒼術藥用和非藥用部位揮發油成分分析及體外抗菌活性考察Δ

張建云，趙艷云，趙云生，閆宗圣，盧利濤，鄭玉光，3，房慧勇#（.河北中醫學院藥學院/河北省中藥炮制技術創新中心，石家莊 050200；2.河北省中藥資源利用與質量評價國際聯合研究中心，石家莊 050200；3.河北化工醫藥職業技術學院，石家莊 050026）

蒼術為菊科植物茅蒼術Atractylodes lancea（Thunb.）DC. 或 北 蒼 術 Atractylodes chinensis（DC.）Koidz.的干燥根莖，含揮發油、芳香苷類、黃酮類等多種化學成分，具有調節腸胃運動、抗菌、抗炎、保護心血管等作用[1]。據《名醫別錄》《本草經集注》記載，含蒼術的中藥復方可治療癬瘡、皮膚瘙癢等疾病[2]。北蒼術是蒼術的重要基原之一，但由于其野生資源瀕危、臨床需求量不斷增加，雖然其人工種植面積在不斷擴大，但目前仍不能滿足市場需求，價格不斷升高[3]。因此，如何提高北蒼術的利用率成為當前急需解決的問題。

北蒼術的傳統使用僅以根莖入藥，其他部位在采收加工過程中常被當作廢棄物丟棄，造成資源浪費。合理開發利用藥用植物非藥用部位及加工過程中副產物，不僅可以避免資源浪費，還可促進中藥種植產業健康發展[4]。目前已有學者發現多種藥用植物的非藥用部位具有較好的開發利用價值，如西紅花非藥用部位具有抗氧化、抗炎和保肝的功效[5]；黃連須根部分可替代原藥材，用于治療豬冬痢等[6]。王喆等[7]研究發現，北蒼術根莖部位揮發油對臨床常見致病菌（如大腸埃希氏菌等）具有抑制作用，是其發揮抗菌活性的主要活性部位。然而，目前對北蒼術須根和莖葉部位揮發油化學成分及體外抗菌作用的研究尚未見報道。基于此，本研究擬對北蒼術藥用部位和非藥用部位揮發油成分進行對比研究，并初步考察其體外抗菌活性，以期為促進北蒼術非藥用部位的合理開發和北蒼術資源的綜合利用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有7890B/5977B型氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）儀（美國Agilent公司）、FW100型粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）、BSA224S-CW型萬分之一電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]、GHP-9050型恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

藥材樣品于2020年10月采自河北省承德市隆化縣中藥材科技創新示范基地，經河北中醫學院藥學院嚴玉平教授鑒定為北蒼術A.chinensis（DC.）Koidz.植株。收集北蒼術植株的地上部分（莖葉），并采集地下部分（根莖、須根），隨后帶回實驗室自然晾干，撞下須根。正己烷為色譜純，純度≥98%；其他試劑均為分析純。

1.3 病原菌

金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、白色葡萄球菌Staphylococcus albus、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis均購自北京北納凱創生物技術有限公司。

2 方法與結果

2.1 北蒼術各部位揮發油中化學成分的分離鑒定

2.1.1 揮發油提取及處理 稱取北蒼術根莖、須根、莖葉各100 g（粉碎并過三號篩），置于2 000 mL圓底燒瓶中，加水1 000 mL，加入沸石，搖勻，浸泡2 h，按2020年版《中國藥典》（四部）通則“揮發油測定法（甲法）”提取揮發油[1]。保持所提取的混合物微沸4 h，讀取揮發油體積并轉移至2 mL離心管中，加入少量無水硫酸鈉，置于4℃冰箱，備用。其中，北蒼術根莖、須根、莖葉揮發油的得率分別為1.93%、0.37%、0.07%。臨用時，精密吸取100 μL上述揮發油，分別置于10 mL量瓶中，加入正己烷稀釋并定容，然后經0.45 μm微孔濾膜過濾，吸取濾液進行GC-MS分析。

2.1.2 GC-MS分析條件 GC條件：色譜柱為Agilent HP-5MS彈性石英毛細管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；采用程序升溫模式進行色譜分離，初始溫度以100℃保持2 min，再以3℃/min升至120℃并保持2 min，然后以2℃/min升至150℃并保持2 min，最后以10℃/min升至230℃；進樣口溫度為250℃；載氣為高純氦氣（99.999%）；流速為1.0 mL/min；分流比為10∶1；進樣量為1 μL。質譜條件：離子源為電子轟擊離子源，離子源溫度為230℃；四極桿溫度為150℃；電子能量為70 eV；溶劑延遲時間為4 min；采用全掃描方式，掃描質量范圍為m/z 50～550。

2.1.3 北蒼術不同部位揮發油成分分析 取“2.1.1”項下根莖、須根和莖葉部位的揮發油提取物各3份，分別按“2.1.2”項下條件進樣分析，得到北蒼術不同部位揮發油化學成分的GC-MS總離子流圖，見圖1。通過與Quant Analysis（B.09.00）定量分析軟件、標準數據庫NIST17.0以及文獻[8-11]比對進行成分鑒定，并采用峰面積歸一化法計算不同部位揮發油中化學成分的相對含量，見表1。結果顯示，從北蒼術不同部位揮發油中共鑒定出60種化學成分，主要為萜烯類、倍半萜類、醇類、酮類等化合物。隨后，將不同部位揮發油中化學成分的相對含量導入Origin 2020軟件，以歐氏距離算法繪制聚類熱圖，見圖2。結果顯示，北蒼術根莖和須根中揮發油的化學成分組成更為相似；而根莖、須根與莖葉相比，揮發油的化學成分組成差異較大。

圖1 北蒼術不同部位揮發油成分分析的GC-MS總離子流圖

結合表1和圖2可以看出，從北蒼術莖葉揮發油中共鑒定出42種成分，有20種成分的相對含量大于1%；其中以β-倍半水芹烯的相對含量（14.83%）最高，其次是γ-蓽澄茄烯（8.60%）、2-亞甲基-4，8，8-三甲基-4-乙烯基[5.2.0]壬烷（6.52%）。從北蒼術根莖揮發油中共鑒定出26種成分，其中4-聯苯甲醛為根莖揮發油的主要成分，其相對含量為31.56%；此外，β-桉葉醇、β-倍半水芹烯、沉香螺萜醇、蒼術酮等成分在根莖揮發油中的相對含量也較高，分別為18.68%、7.16%、4.93%、4.60%。從北蒼術須根揮發油中共鑒定出21種成分，其中β-桉葉醇（44.39%）、4-聯苯甲醛（18.14%）和沉香螺萜醇（11.41%）的相對含量都在10%以上。北蒼術須根與根莖揮發油中的共有成分有21種，包括silphinene、modhephene、蓽澄茄烯、異松香烯、berkheyaradulene、β-石竹烯、α-葎草烯等；根莖、莖葉和須根揮發油中的共有成分有8種，分別為欖香醇、蓽澄茄烯、沉香螺萜醇、巴倫西亞橘烯、石竹素、β-倍半水芹烯、γ-桉葉醇和β-桉葉醇。

圖2 北蒼術不同部位揮發油成分聚類分析結果

表1 北蒼術不同部位揮發油成分分析結果

2.2 北蒼術不同部位揮發油抗菌活性考察

2.2.1 揮發油抗菌效果測定 采用紙片擴散法測定北蒼術不同部位揮發油對金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抗菌活性。將上述3種供試菌接種到NB培養基（未加瓊脂）中擴大培養，調整菌液密度至1×107CFU/mL。吸取上述菌液100 μL加到預先準備好的NA培養基中，并用涂布器均勻涂滿表面。為了讓揮發油更好地吸附在濾紙上，按1∶1（m/m）的比例加入二甲基亞砜稀釋揮發油，然后經0.45 μm微孔濾膜過濾除菌。在距NA培養基中心2.5 cm處，放置3張直徑為0.5 cm的圓形無菌濾紙，滴加5 μL質量濃度為5 mg/mL的藥液[12]；以滴加5 μL二甲基亞砜的培養基作為陰性對照。將培養基置于37℃恒溫培養箱培養24 h，然后使用D7200型尼康相機記錄抗菌實驗結果，使用Image J 1.8.0軟件測量抑菌圈直徑，抑菌圈直徑越大表示抗菌效果越好。實驗重復3次。實驗數據用Excel 2016軟件整理并制表，采用Graph Pad Prism 8.0軟件進行統計分析；采用單因素方差分析和LSD檢驗對北蒼術不同部位揮發油的抗菌效果進行比較；檢驗水準α＝0.05。結果見圖3。

圖3結果顯示，北蒼術不同部位揮發油對白色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均有較好的抗菌作用，但抗菌效果有所差異；二甲基亞砜對揮發油的抗菌活性無影響。其中，根莖揮發油的抗菌效果最佳，須根揮發油的抗菌效果次之，莖葉揮發油的抗菌效果相對較弱。莖葉、根莖和須根揮發油對白色葡萄球菌的抗菌效果差異無統計學意義（P＞0.05）；莖葉、須根揮發油對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抗菌效果顯著弱于根莖揮發油（P＜0.05），但須根揮發油對金黃色葡萄球菌的抗菌作用顯著強于莖葉揮發油（P＜0.05）。

圖3 北蒼術不同部位揮發油的抗菌效果（±s，n=3）

2.2.2 揮發油成分與抗菌活性相關性分析 利用RStudio 4.0.2軟件，采用隨機森林回歸算法，將各成分的相對含量進行Z-score標準化，并將北蒼術3個部位揮發油的體外抗菌活性實驗結果作為因變量進行特征分析，計算抗菌活性實驗下北蒼術不同部位揮發油中各化學成分的重要特征值[13]，標記累計特征相對重要度排名前15位的化合物。隨后，運用Origin 2020軟件，采用Pearson算法，對預測出的15種重要化合物進行抗菌效果與化學成分之間的相關性分析（圖4）。結果，累計特征相對重要度排名前15位的化合物分別為蒼術酮、modhephene、β-桉葉醇、欖香烯、β-石竹烯、環苜蓿烯、α-紫穗槐烯、沉香螺萜醇、γ-依蘭油烯、桉油烯醇、α-葎草烯、姜稀、α-依蘭油稀、α-法尼烯、白菖烯。其中，β-石竹烯、α-葎草烯和modhephene的相對含量與揮發油對金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的抑制效果呈顯著正相關（P＜0.05或P＜0.01），相關系數為0.87～0.88；蒼術酮、姜烯和沉香螺萜醇的相對含量與揮發油對枯草芽孢桿菌的抑制效果呈顯著正相關（P＜0.05或P＜0.01），相關系數為0.75～0.95；但這15種成分的相對含量對白色葡萄球菌的抑制效果均無顯著相關性（P＞0.05）。

圖4 北蒼術不同部位揮發油中化學成分與其抗菌效果的相關性分析結果

3 討論

藥用植物的非藥用部位生物量大，通常具有與藥用部位相同或相似的生物活性成分，有廣闊的開發潛力和應用前景。本研究通過比較北蒼術非藥用部位（須根、莖葉）與藥用部位（根莖）揮發油中的8種共有成分發現，須根、根莖揮發油中4-聯苯甲醛、β-桉葉醇的相對含量較高，而莖葉揮發油中β-倍半水芹烯的相對含量較高。可見，北蒼術不同部位揮發油中化學成分的組成及相對含量差異較大。而且，其非藥用部位也含有多種藥效物質，如須根揮發油中富含的β-桉葉醇，具有促進胃腸運動、抗肝毒活性、抗腫瘤、鎮靜、鎮痛等藥理功能[14]。此外，根莖揮發油幾乎包含了須根揮發油中的26種化學成分，莖葉揮發油中化學成分的種類多于根莖和須根，其更多的藥理活性有待進一步研究。Chen等[15]對北蒼術無菌苗的研究發現，其根、莖及葉片均具有合成倍半萜類化合物的能力——石竹烯氧化物和蒼術酮的含量在根中不斷積累，β-石竹烯、姜烯、β-倍半水芹烯、石竹烯氧化物等多種成分均在莖及葉片中積累。這一發現與本文結果有一定差異，這可能是因為無菌環境與自然界的自然環境對植物生理生化功能的影響不同。

已有研究結果表明，蒼術干燥根莖具有抵抗金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等的活性[16]，蒼術地上部分對大腸桿菌具有較好的抗菌活性[17]，但有關北蒼術須根抗菌活性的研究尚未見相關報道。本研究抗菌實驗結果表明，北蒼術不同部位揮發油均具有抗白色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的活性，抗菌作用強弱順序為根莖＞須根＞莖葉。須根揮發油抗菌活性強于莖葉揮發油，這可能跟須根揮發油與根莖揮發油的組成更為相似，根莖揮發油中包含須根揮發油的大部分成分有關。

綜上，北蒼術根莖、須根、莖葉揮發油的化學成分在種類和含量上差別較大，藥用部位（根莖）和非藥用部位（須根、莖葉）揮發油對白色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均具有一定的抗菌活性。本課題組后期將對北蒼術非藥用部位的藥用價值展開更多研究，進一步促進北蒼術資源的綜合開發和利用。