補腎強身片對多囊卵巢綜合征模型大鼠的干預作用及機制研究Δ

張明昊，高一盈，董文霞，薛鵬坤，馬偉洋，張大偉，馬麗亞（.河南中醫藥大學醫學院，鄭州450046；.河南中醫藥大學第三附屬醫院婦產科，鄭州 450008；3.河南中醫藥大學臨床技能實訓中心，鄭州 450046）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）屬婦科內分泌疾病范疇，常見于青春期和育齡期女性，主要臨床癥狀為月經失調、慢性無排卵、雄激素水平升高及卵巢多囊樣改變，并伴隨生殖功能障礙、胰島素抵抗（insulin resistance，IR）等代謝異常癥狀[1]。目前西醫治療PCOS多以激素替代、調經及促排卵為主，但患者妊娠率低，且存在子宮異常出血、胃腸道不適、肝功能損害等多種副反應[2-3]。中醫古籍尚無PCOS記載，根據臨床表現可將其歸為“不孕癥”“閉經”“月經過少”“月經后期”“癥瘕”范疇，其發病以腎虛為本，繼發肝瘀、脾虛、痰飲、水濕互結，終成PCOS[4-5]。故中醫治療PCOS多從補益脾腎入手，進而補腎助陽、溫通胞絡、滋陰填精，療效明顯[6]。

補腎強身片是由淫羊藿、菟絲子、金櫻子、女貞子和狗脊（燙）5味中藥加工而成的中藥成方制劑，收錄于《衛生部藥品標準中藥成方制劑》（第十五冊），具有補腎強身的功效。方中淫羊藿、菟絲子均可治療PCOS，且作用機制與磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）信號通路相關[7-8]。該通路的下游信號蛋白有哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）和葡萄糖轉運蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4），可以分別調控細胞自噬和胰島素抵抗，進而影響卵泡發育和卵巢多囊性改變[9]，且臨床研究中也證實了PCOS患者存在PI3K、Akt水平降低的情況[10]。基于此，筆者建立PCOS模型大鼠模型，觀察補腎強身片對大鼠激素水平及卵巢病理變化的影響，并基于PI3K/Akt/mTOR和PI3K/Akt/GLUT4信號通路探討補腎強身片的作用機制。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有BSA124S-CW型電子天平（德國Sartorius公司），SpectraMax iD3型酶標儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]，RM2235型石蠟切片機（德國Leica公司），L720R-3型冷凍離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司），YD-6D型組織包埋機、YD-A型組織攤片機、YD-B型組織烤片機（金華市科迪儀器設備有限公司），CX23型光學顯微鏡（日本Olympus公司），StepOneTM型實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國ABI公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用的主要藥品與試劑有補腎強身片[景忠山國藥（唐山）有限公司，批號200502，規格0.28 g/片]，炔雌醇環丙孕酮片（拜耳醫藥保健有限公司，批號KT062FL2，規格0.2 mg/片），鹽酸二甲雙胍片（上海壽如松藥業泌陽制藥有限公司，批號20031702，規格0.25 g/片），來曲唑（上海麥克林生化科技有限公司，批號C12785740），羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，國藥集團化學試劑有限公司，批號20160704），氨基甲酸乙酯（天津市光復科技發展有限公司，批號20210902），蘇木素染色液、伊紅染色液（福州飛凈生物科技有限公司，批號分別為190805、20211009），雌二醇（estrogen，E2）、睪酮（testosterone，T）、促性腺激素釋放激素（gonadotropinreleasing hormone，GnRH）、促卵泡素（follicle stimulating hormone，FSH）、促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為 H102-1、H090-1-2、H297、H101-1-2、H206-1-2），兔SP試劑盒、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號分別為SP-9001、ZLI-9018），兔抗大鼠磷酸化Akt（p-Akt）、磷酸化mTOR（p-mTOR）抗體（北京博奧森生物技術有限公司，批號分別為bs-6417R、bs-5331R），兔抗大鼠PI3K抗體、兔抗大鼠GLUT4抗體、總RNA提取試劑、cDNA合成試劑盒、實時熒光定量PCR擴增試劑（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號分別為GN11769、GB11244、R1100、G3330、G3320）。PCR 引物根據 GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）已發表的大鼠 PI3K、Akt、mTOR、GLUT4、GAPDH基因序列設計（引物序列及擴增產物長度見表1），并由武漢塞維爾生物科技有限公司合成。

表1 引物序列及擴增產物片段長度

1.3 動物

本研究所用動物為健康SD雌性大鼠，8周齡，體質量180～200 g，購自鄭州市惠濟區華興實驗動物養殖場，動物生產許可證號為SCXK（豫）2019-0002。所有大鼠分籠飼養于河南中醫藥大學醫學機能實驗室，室溫為20～22℃，相對濕度為55%～60%，正常光照，期間大鼠均自由飲水采食。本實驗獲河南中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（批準號DWLL202201010），實驗過程及動物處置嚴格遵守“3R”原則。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

取大鼠50只，適應性飼養1周后，按1 mg/kg灌胃來曲唑混懸液造模，每天1次，連續21 d，造模第16天開始進行陰道涂片檢測，當光鏡下可見陰道上皮細胞持續角化則表明造模成功[11]。將造模成功的50只大鼠按體質量隨機分為模型組、陽性對照組（炔雌醇環丙孕酮片0.2 mg/kg+鹽酸二甲雙胍片230 mg/kg，劑量均為臨床等效劑量）和補腎強身片低、中、高劑量組（189、378、756 mg/kg，中劑量為臨床等效劑量），每組10只。另取10只未造模大鼠作為正常組。上述各藥物均以0.1%CMC-Na制成混懸液后進行灌胃給藥，灌胃體積為10 mL/kg，正常組大鼠灌胃等體積0.1%CMC-Na溶液，每天給藥1次，連續30 d。

2.2 取材及處理

末次灌胃24 h后，各組大鼠稱體質量后腹腔注射1 g/kg氨基甲酸乙酯麻醉，腹主動脈取血，血樣以3 000 r/min離心10 min，取上層血清于-80℃下保存。取血后，將大鼠處死，剖取卵巢，去除周圍組織，以生理鹽水洗滌后觀察卵巢外觀形態；以濾紙吸盡卵巢表面液體后稱質量，然后將卵巢一分為二，其中一份用4%多聚甲醛固定，另一份用液氮速凍后于-80℃下儲存。

2.3 大鼠血清中E2、T、GnRH、FSH、LH水平的檢測

取“2.2”項下各組大鼠的血清樣品，室溫融化，按照試劑盒說明書方法操作，采用酶標儀于450 nm波長處測定吸光度，并根據標準曲線計算大鼠血清中E2、T、GnRH、FSH、LH水平。

2.4 大鼠卵巢系數的計算

統計各組大鼠卵巢質量與體質量，計算卵巢系數（卵巢系數＝卵巢質量/體質量），以此來評價卵巢的病變程度。

2.5 大鼠卵巢組織病理形態學觀察

取“2.2”項下固定于4%多聚甲醛的卵巢組織，經梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片（4 μm）后，以二甲苯脫蠟；取部分切片（其余部分用于免疫組織化學染色），經蘇木素-伊紅（HE）染色后，以梯度乙醇脫水、中性樹膠封片，然后于光學顯微鏡下觀察卵巢組織的病理形態學變化，并根據卵巢囊性病變進行評分：正常記0分；閉鎖及無卵丘的囊性卵泡占卵泡總量的百分比≤25%記1分；閉鎖及無卵丘的囊性卵泡占卵泡總量的百分比在＞25%～＜50%之間記2分；閉鎖及無卵丘的囊性卵泡占卵泡總量的百分比在50%～＜75%之間記3分；閉鎖及無卵丘的囊性卵泡占卵泡總量的百分比≥75%記4分[12]。

2.6 大鼠卵巢組織中PI3K、Akt、mTOR、GLUT4 mRNA表達水平的檢測

采用實時熒光定量PCR法進行檢測。取卵巢組織100 mg，加入TriQuick試劑1 mL充分研磨勻漿后提取總RNA，并檢測總RNA濃度及純度。取總RNA適量，在20 μL反應體系內合成cDNA，再以2 μL cDNA為模板，加入靶基因上下游引物，于15 μL反應體系內進行PCR擴增。反應結束后，根據擴增曲線及溶解曲線判斷PCR反應特異性。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA的表達水平。

2.7 大鼠卵巢組織中PI3K、p-Akt、p-mTOR、GLUT4蛋白表達水平的檢測

采用免疫組織化學染色法進行檢測。取“2.5”項下各組大鼠剩余的切片，經二甲苯脫蠟、水化后，用檸檬酸鹽緩沖液熱修復8 min；待切片溫度降至室溫后，以H2O2孵育10 min，PBS浸洗3次，每次3 min；以山羊血清孵育30 min，然后滴加PI3K（稀釋度為1∶1 000）、p-Akt（稀釋度為1∶100）、p-mTOR（稀釋度為1∶100）、GLUT4（稀釋度為1∶400）抗體，4℃孵育過夜。次日將切片于37℃復溫30 min，滴加二抗孵育20 min，PBS浸洗3次，每次3 min；以DAB顯色10 min，自來水沖洗終止顯色；再以蘇木素復染切片3 min，經鹽酸乙醇分化后，以自來水沖洗，經乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后，采用顯微鏡進行觀察。每張切片在顯微鏡下隨機選取1個視野，以棕黃色為陽性染色，采用Image-Pro Plus 6.0軟件測定每個視野中陽性染色區域的積分光密度（integrated optical density，IOD）值，以表示各蛋白的表達水平。

2.8 統計學方法

數據采用SPSS 26.0軟件進行統計分析，計量資料均采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間方差齊時兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差不齊時采用Dunnett’s檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 大鼠卵巢外觀形態的觀察結果

正常組大鼠卵巢外觀形態正常，呈淡粉色，表面有不規則結節狀卵泡；模型組大鼠卵巢稍增大，顏色稍蒼白，表面布滿小囊，結節狀卵泡減少；陽性對照組和補腎強身片各劑量組大鼠卵巢病變情況相對模型組較輕。

3.2 大鼠卵巢系數的計算結果

與正常組比較，模型組大鼠卵巢系數顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組和補腎強腎片各劑量組大鼠卵巢系數顯著減小（P＜0.05）。結果見表2。

表2 各組大鼠卵巢系數和卵巢囊性病變評分的計算結果（±s，n=10）

表2 各組大鼠卵巢系數和卵巢囊性病變評分的計算結果（±s，n=10）

a：與正常組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組陽性對照組補腎強身片低劑量組補腎強身片中劑量組補腎強身片高劑量組卵巢系數（×10-4）6.68±0.44 7.73±0.43a 5.16±0.54b 5.58±0.60b 6.01±0.73b 5.73±0.93b卵巢囊性病變評分/分0 3.67±0.52a 1.33±0.52b 1.67±0.82b 1.50±0.55b 1.33±0.52b

3.3 大鼠血清中E2、T、GnRH、FSH、LH水平的測定結果

與正常組比較，模型組大鼠血清中E2、FSH水平均顯著降低（P＜0.05），T、GnRH、LH水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組和補腎強身片各劑量組大鼠血清中T、GnRH、LH水平均顯著降低（P＜0.05），E2（補腎強身片低劑量組除外）、FSH水平均顯著升高（P＜0.05）。結果見表3。

表3 各組大鼠血清中E2、T、GnRH、FSH、LH水平的測定結果（±s，n=10）

表3 各組大鼠血清中E2、T、GnRH、FSH、LH水平的測定結果（±s，n=10）

a：與正常組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組陽性對照組補腎強身片低劑量組補腎強身片中劑量組補腎強身片高劑量組E2/（pmol/L）49.49±11.59 28.81±10.11a 57.32±17.71b 31.47±7.00 53.90±13.98b 49.92±19.09b T/（nmol/L）1.29±0.42 1.95±0.23a 1.23±0.42b 1.09±0.40b 1.09±0.43b 1.07±0.33b GnRH/（mIU/mL）42.27±5.33 56.82±7.37a 36.64±9.66b 37.05±4.41b 46.70±5.78b 38.48±4.86b FSH/（mIU/mL）62.72±12.07 23.33±5.42a 76.38±13.77b 59.83±6.50b 62.41±13.43b 66.70±7.72b LH/（mIU/mL）64.16±3.75 75.78±11.80a 51.60±5.04b 57.25±4.57b 48.91±6.41b 47.33±7.91b

3.4 大鼠卵巢組織病理形態學觀察結果

HE染色結果顯示，正常組大鼠卵巢組織結構完整，原始卵泡、生長卵泡與成熟卵泡數量較多、發育良好，存在正常的黃體和白體；模型組大鼠卵巢皮質膠原化，閉鎖卵泡及無卵丘的囊性卵泡數量增多，卵泡顆粒細胞層數減少；陽性對照組大鼠卵巢組織結構完整，原始卵泡、生長卵泡與成熟卵泡形態較為完整，放射冠清晰，無囊性改變，卵泡顆粒細胞層數明顯增加，存在少量黃體和白體；補腎強身片低劑量組大鼠卵巢組織中可見較多的閉鎖卵泡和無卵丘囊性卵泡，卵泡顆粒細胞層數減少；補腎強身片中、高劑量組大鼠卵巢組織中含有原始卵泡、生長卵泡與成熟卵泡，卵泡顆粒細胞層數增加，放射冠清晰，存在少量黃體和白體，未見卵泡囊性改變。卵巢囊性病變評分結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠卵巢囊性病變評分顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組和補腎強身片各劑量組大鼠卵巢囊性病變評分均顯著降低（P＜0.05）。結果見圖1、表2。

圖1 各組大鼠卵巢組織的病理形態學觀察結果（HE染色，×100）

3.5 大鼠卵巢組織中PI3K、Akt、mTOR、GLUT4 mRNA表達水平的測定結果

與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織中PI3K、Akt、mTOR、GLUT4 mRNA表達水平均顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組和補腎強身片各劑量組大鼠卵巢組織中PI3K、Akt、mTOR、GLUT4 mRNA表達水平均顯著升高（P＜0.05）。結果見表4。

表4 各組大鼠卵巢組織中PI3K、Akt、mTOR、GLUT4 mRNA表達水平的測定結果（±s，n=10）

表4 各組大鼠卵巢組織中PI3K、Akt、mTOR、GLUT4 mRNA表達水平的測定結果（±s，n=10）

a：與正常組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組陽性對照組補腎強身片低劑量組補腎強身片中劑量組補腎強身片高劑量組PI3KmRNA 1.12±0.09 0.96±0.06a 5.49±0.25b 3.37±0.20b 3.99±0.38b 4.83±0.60b AktmRNA 1.09±0.06 0.61±0.11a 1.69±0.10b 1.20±0.16b 1.18±0.06b 1.30±0.10b mTORmRNA 1.07±0.09 0.56±0.07a 2.27±0.25b 1.14±0.09b 1.50±0.11b 2.27±0.25b GLUT4mRNA 1.13±0.08 0.77±0.09a 2.32±0.40b 1.05±0.11b 1.43±0.14b 1.91±0.22b

3.6 大鼠卵巢組織中PI3K、p-Akt、p-mTOR、GLUT4蛋白表達水平的測定結果

正常組大鼠卵巢組織中有大量PI3K、p-Akt、pmTOR、GLUT4蛋白表達。與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織中有少量PI3K、p-Akt、p-mTOR、GLUT4蛋白表達，陽性表達IOD值均顯著減小（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組和補腎強身片中、高劑量組大鼠卵巢組織中有大量PI3K、p-Akt、p-mTOR、GLUT4蛋白表達，陽性表達IOD值均顯著增加（P＜0.05）；補腎強身片低劑量組大鼠卵巢組織中有大量PI3K、p-mTOR蛋白表達，陽性表達IOD值顯著增加（P＜0.05）。結果見表5、圖2。

圖2 各組大鼠卵巢組織中PI3K、p-Akt、p-mTOR、GLUT4蛋白表達的免疫組織化學染色圖（×400）

表5 各組大鼠卵巢組織中PI3K、p-Akt、p-mTOR、GLUT4蛋白IOD值的測定結果（±s，n=10）

表5 各組大鼠卵巢組織中PI3K、p-Akt、p-mTOR、GLUT4蛋白IOD值的測定結果（±s，n=10）

a：與正常組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組陽性對照組補腎強身片低劑量組補腎強身片中劑量組補腎強身片高劑量組GLUT4（×103）358.86±53.51 117.88±26.29a 412.80±66.11b 167.71±44.24 339.99±55.07b 402.23±64.04b PI3K（×103）294.97±38.57 147.58±14.76a 428.77±51.68b 199.65±21.49b 264.28±40.17b 335.23±16.50b p-Akt（×103）286.26±40.73 61.98±10.38a 377.09±60.99b 110.94±11.24 268.90±58.06b 342.81±44.54b p-mTOR（×103）372.93±41.91 227.08±39.89a 528.46±63.27b 292.43±39.13b 387.59±40.32b 414.98±33.39b

4 討論

PCOS是目前造成育齡期女性不孕的主要病因之一，其動物模型可由類固醇、胰島素聯合人絨毛膜促性腺激素誘導或轉基因等多種方式構建，其中以雄激素、芳香化酶抑制劑誘導的PCOS模型應用較為廣泛。來曲唑是一種人工合成的芐三唑類衍生物，可以通過抑制芳香化酶活性而下調雄激素向雌激素的轉化，致使卵巢內源性雄激素水平持續升高，進而造成機體性周期紊亂、卵巢排卵障礙及多囊性改變[13]。本研究采用來曲唑誘導構建了大鼠PCOS模型，結果發現，模型大鼠血清中E2、FSH水平降低，T、GnRH、LH水平升高，卵巢稍增大且出現多囊性改變，表明造模成功。

西醫治療PCOS以激素替代、調經及促排卵為主，可改善PCOS癥狀，但難以達到根治目的。中醫理論認為，PCOS與腎虛、脾虛、肝郁、痰濕和血瘀有關[4,14]。補腎強身片是補腎強身的中藥成方制劑，以淫羊藿為君藥，補腎壯陽，大補元陽；以菟絲子為臣藥，補益肝腎，固精安胎；以狗脊、女貞子為佐藥，補腎滋陰，補氣疏肝；金櫻子可固精明目；諸藥合用，既補腎陽，又滋腎陰，共達“陰陽雙補”之效[15]。由于雄激素水平較高和IR是PCOS的兩個典型特征，因此，臨床上常采用炔雌醇環丙孕酮片聯合鹽酸二甲雙胍片治療PCOS[16]。基于此，本研究選擇炔雌醇環丙孕酮片+鹽酸二甲雙胍片作為陽性對照藥。本研究發現，經補腎強身片干預后，PCOS模型大鼠卵巢組織中各級卵泡數量增加，囊性卵泡數量減少，卵泡顆粒細胞層數增加，卵巢系數減小，這表明補腎強身片對PCOS模型大鼠具有較好的改善作用。

GnRH由下丘腦分泌，可與下丘腦和腺垂體的GnRH受體（GnRH receptor，GnRH-R）結合后作用于垂體前葉促性腺激素細胞，進而調控LH和FSH的分泌過程[17]。LH和FSH均由垂體前葉促性腺激素細胞分泌，與卵巢顆粒細胞分泌的E2協同作用于卵巢，調控雌、孕激素的分泌[18]。PCOS患者長期大量分泌GnRH，使GnRH-R低表達且敏感性下降，并升高LH水平，降低FSH水平；而高水平的LH可刺激卵泡膜細胞合成大量T，低水平的FSH則可降低卵巢顆粒細胞中芳香化酶的活性，使T向雌激素的轉化進程受阻，從而導致卵泡發育障礙，進而形成卵巢多囊性病變[19]。此外，卵巢顆粒細胞分泌E2水平下降也是加劇卵泡閉鎖與排卵障礙的主要原因[20]。本研究發現，經補腎強身片干預后，PCOS模型大鼠血清中E2、FSH水平升高，T、GnRH、LH水平降低，表明補腎強身片可以通過調控性激素分泌水平干預PCOS。

PI3K由1個催化亞基p110和1個調節亞基p85組成，其中p85含有SH2和SH3兩個結構域，可與靶蛋白結合；當PI3K接收酪氨酸激酶和G蛋白偶聯受體的信號后，其p85調節亞基可向質膜富集并與p110亞基結合，進而將底物磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸磷酸化為磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（phosphatidyli-nositol-3，4，5-triphosphate，PIP3）[21]。在3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1的參與下，PIP3與Akt結合并磷酸化Akt蛋白上的蘇氨酸位點（Thr308）和絲氨酸位點（Ser473），從而激活Akt[11]。活化的p-Akt可以解除結節性硬化癥相關基因1（tuberous sclerosis complex 1，TSC1）和TSC2對腦組織富含的Ras同源物的抑制作用，從而激活mTOR[21]。mTOR是PI3K/Akt信號通路下游的重要因子之一，活化的p-mTOR可促使4E結合蛋白1與翻譯起始因子解離以及核糖體S6蛋白激酶的磷酸化，從而調節下丘腦-垂體-性腺軸，進而調控雌激素分泌與卵泡生長發育[22]。臨床研究也證實，PCOS患者卵巢組織中PI3K、Akt、mTOR蛋白表達降低[23]，由此推測卵巢多囊性改變和卵泡發育障礙均與PI3K/Akt/mTOR信號通路的下調有關。GLUT4是一種類胰島素敏感型葡萄糖轉運載體，與IR的發生密切相關。在正常生理狀態下，胰島素可與靶器官表面的胰島素受體α亞基結合，激活酪氨酸蛋白激酶，進而磷酸化胰島素受體底物1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）和IRS-2；磷酸化后的IRS-1可與PI3K的p85亞基結合，從而活化PI3K、磷酸化Akt，進而誘導GLUT4表達，當PI3K、Akt蛋白水平降低時，GLUT4表達降低，從而阻礙葡萄糖由細胞外轉運至細胞內，導致IR[24]。卵巢局部IR可以通過多種途徑影響下丘腦-垂體-性腺軸，使卵巢局部保持高雄激素水平環境，阻礙卵泡成熟，最終導致卵巢多囊性改變[24]。本研究發現，經補腎強身片干預后，PCOS模型大鼠卵巢組織中PI3K、p-Akt、p-mTOR、GLUT4蛋白表達水平及 PI3K、Akt、mTOR、GLUT4 mRNA表達水平均升高，提示補腎強身片可通過上調PI3K/Akt/mTOR、PI3K/Akt/GLUT4兩條信號通路來干預PCOS。

綜上所述，補腎強身片可調節PCOS模型大鼠性激素分泌水平，改善卵巢囊性病變，其作用機制可能與上調PI3K/Akt/mTOR、PI3K/Akt/GLUT4兩條信號通路有關。