西地那非對腎缺血再灌注損傷大鼠氧化應激及腎小管細胞凋亡的影響

王可娜，張 嬌，徐家云

（河南科技大學第一附屬醫院，河南 洛陽 471000）

腎缺血再灌注損傷（renal ischemia reperfusion injury，RIRI）是諸多疾病及醫療過程如休克、移植等過程產生的病理生理過程，發病機制復雜，其中腎移植過程中RIRI難以避免，可對移植腎的早期及遠期功能帶來一定影響，嚴重影響患者預后[1]。目前，臨床仍缺乏有效治療手段對RIRI起到完美保護作用。因此，探尋有效藥物治療RIRI仍是臨床研究熱點。西地那非是5型磷酸二酯酶抑制劑，對RIRI具有一定保護作用[2]，但具體作用機制尚未闡明。研究[3]表明，RIRI主要病理改變是缺血引起的氧化應激損傷及腎小管細胞凋亡。抑制凋亡相關因子Fas/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8（Fas/Caspase-8）通路活化可抑制RIRI大鼠腎小管細胞氧化應激凋亡[4]。目前，有關西地那非對RIRI的保護作用是否與調控Fas/Caspase-8通路有關少見報道，因此本研究基于Fas/Caspase-8通路探究西地那非對RIRI大鼠氧化應激及腎小管細胞凋亡的影響，以期為臨床有效防治RIRI改善腎移植患者預后提供一定參考。

1 主要材料與試劑

1.1 實驗動物

40只SPF級SD雄性大鼠（10周齡），體質量180～240 g，平均體質量（213±27）g，購自北京唯尚立德生物科技有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0009。

1.2 主要試劑與儀器

鹽酸西地那非，國藥準字H20143255，購自廣州白云山醫藥集團股份有限公司白云山制藥總廠；蘇木精-伊紅（Hematoxylin-Eosin，HE）染色試劑盒，購自北京百瑞極生物科技有限公司；原位末端標記（TdT-mediateddUTPnickandlabeling，TUNEL）試劑盒購自上海聯邁生物工程有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide orgotein dismutase，SOD）活性檢測試劑盒、丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量檢測試劑盒均購自南京建成生物研究所；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）酶聯免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒，購自上海梵態生物科技有限公司；兔抗鼠凋亡相關因子Fas、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8（Caspase-8）及β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體、山羊抗兔HRP二抗，均購自上海研卉生物科技有限公司。

Optima?XPN超速離心機，購自貝克曼庫爾生物科技有限公司；BD-SW50光學顯微鏡，購自深圳市博視達光學儀器有限公司；MouseDoppler型小動物超聲多普勒血流儀，購自技爾（上海）商貿有限公司；Atellica CH930型全自動生化分析儀及配套試劑，購自上海聚慕醫療器械有限公司。

2 實驗方法

2.1 分組及模型建立[5]

將大鼠隨機分為假手術組、模型組及西地那非低、中、高劑量組，每組8只。模型組及西地那非低、中、高劑量組腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，背部皮膚消毒，切開腰背筋膜，分離腎周圍組織，暴露雙側腎臟，以無創動脈夾夾閉雙側腎蒂血管，45 min后松動無創動脈夾恢復血流再灌注（以小動物超聲血流儀未監測到血流為缺血標志，以監測到血流為再灌注成功標志），之后逐層縫合皮膚，假手術組大鼠除不夾閉腎蒂血管外，其余操作同模型組。再灌注后，西地那非低、中、高劑量組立即腹腔注射25 mg·kg-1·d-1、50 mg·kg-1·d-1、75 mg·kg-1·d-1的鹽酸西地那非溶液[6]，連續2周；假手術組和模型組同時間腹腔注射等量生理鹽水。

2.2 標本采集

第2周末收集各組24 h尿液標本；于末次腹腔注射給藥后1 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，收集尾靜脈血2 mL。以上所收集的樣本均離心10 min（3 000 r·min-1，離心半徑8 cm），取上清液，保存于-80℃冰箱，用于測定24 h尿蛋白及血肌酐水平。各組取血結束后，斷頸處死并取腎臟組織分為兩部分，一部分采用4%多聚甲醛固定，乙醇脫水、透明、石蠟包埋過夜，連續切片，厚6 μm，用于HE染色及TUNEL法檢測；另一部分保存于液氮中，用于氧化應激水平測定及免疫印跡法蛋白檢測。

2.3 測定各組腎功能指標水平[7]

取2.2尿液及血清標本，采用全自動生化分析儀及配套試劑測定24 h尿蛋白、血清中血肌酐水平。

2.4 HE染色觀察各組腎組織病理學變化[8]

取2.2各組部分腎臟組織切片，梯度乙醇脫蠟、復水，之后進行HE染色，以中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察組織病理學變化，并拍照。

2.5 TUNEL技術檢測各組腎小管細胞凋亡情況[9]

取2.2剩余腎臟組織石蠟切片常規脫蠟、水化，PBS洗滌2遍后，加入末端脫氧核苷酰轉移酶反應緩沖液處理10 min，37℃加入末端脫氧核苷酰轉移酶反應混合物反應1 h，最后加入3，3’-二氨基聯苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）反應顯色，蘇木精復染，光學顯微鏡觀察并拍照，細胞核呈棕色或棕褐色為凋亡細胞。每高倍鏡下隨機選取5個視野，計算凋亡細胞數和腎小管細胞總數，取平均值，計算凋亡指數（apoptosis index，AI），AI=凋亡細胞數÷腎小管細胞總數×100%。

2.6 檢測各組腎組織中氧化應激水平[10]

取2.2部分腎臟組織，并制備組織勻漿，離心10 min（3 000 r·min-1，離心半徑8 cm），取上清液，采用比色法測定SOD活性、MDA含量，采用ELISA法檢測GSH-px含量，以上操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

2.7 免疫印跡法檢測各組腎組織中Fas/Caspase-8通路蛋白水平[11]

取2.2大鼠剩余腎臟組織，制備組織勻漿，以RIPA液冰上裂解，孵育20 min，離心10 min（10 000 r·min-1，離心半徑8 cm）取上清，測定蛋白總量并取20 μg與等量上樣緩沖液混勻，變性、電泳、轉膜，以5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST清洗，之后加入Fas、Caspase-8內參及β-actin作為一抗（1:500），4℃孵育過夜，TBST洗滌，加入山羊抗兔二抗（1:1 000），37℃ 1.5 h，顯影、定影，按照各基因蛋白條帶灰度值計算各目標基因蛋白相對表達量。

2.8 統計學方法

用SPSS 22.0軟件分析數據，計量資料均以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 各組腎功能指標水平比較

見表1。

表1 各組腎功能指標水平比較（±s，n= 8）

表1 各組腎功能指標水平比較（±s，n= 8）

注：與假手術組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與西地那非低劑量組比較，▲P＜0.05；與西地那非中劑量組比較，□P＜0.05

組別 Dose/（mg·kg-1）血肌酐/（μmol·L-1）假手術組 - 0.28±0.05 35.03±5.26模型組 - 3.95±0.60# 81.59±12.25#西地那非低劑量組 25 2.88±0.45#△ 62.08±9.32#△西地那非中劑量組 50 1.32±0.19#△ 51.17±7.69#△▲西地那非高劑量組 75 0.85±0.13#△▲ 42.37±6.36#△▲□尿蛋白/（mg·d-1）

3.2 各組腎組織病理學變化

假手術組腎臟組織腎小球及腎小管結構正常，未見炎性細胞浸潤；模型組腎臟組織間質充血、水腫，有大量炎性細胞浸潤，腎小管腫脹且小管上皮細胞形態異常，刷狀緣紊亂消失，管腔內可見脫落的小管上皮細胞；相比于模型組，西地那非低、中、高劑量組病理損傷有所減輕，間質出血減少，水腫減輕，炎性細胞浸潤減少，且西地那非劑量越高則上述病理變化越有所改善。見圖1。

圖1 各組腎組織病理學變化（HE染色，×200）

3.3 各組腎小管細胞凋亡情況比較

見表2、圖2。

圖2 各組腎小管細胞凋亡情況比較（HE染色，×200）

表2 各組腎小管細胞凋亡情況比較（±s，n= 8）

表2 各組腎小管細胞凋亡情況比較（±s，n= 8）

注：與假手術組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與西地那非低劑量組比較，▲P＜0.05；與西地那非中劑量組比較，□P＜0.05

組別 Dose/（mg·kg-1） 細胞凋亡率/%假手術組 - 1.91±0.25模型組 - 7.26±1.09#西地那非低劑量組 25 6.01±0.91#△西地那非中劑量組 50 4.97±0.75#△▲西地那非高劑量組 75 2.85±0.43#△▲□

3.4 各組腎組織氧化應激水平比較

見表3。

表3 各組腎組織氧化應激水平比較（±s，n= 8）

表3 各組腎組織氧化應激水平比較（±s，n= 8）

注：與假手術組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與西地那非低劑量組比較，▲P＜0.05；與西地那非中劑量組比較，□P＜0.05

組別 Dose/（mg·kg-1） SOD/（mg·L-1） MDA/（nmoL·L-1） GSH-px/（U·L-1）假手術組 - 7.36±1.11 2.15±0.31 9.27±1.39模型組 - 2.05±0.31# 6.79±1.08# 3.90±0.59#西地那非低劑量組 25 3.16±0.47#△ 5.11±0.77#△ 5.12±0.78#△西地那非中劑量組 50 4.59±0.68#△▲ 4.02±0.60#△▲ 6.85±1.03#△▲西地那非高劑量組 75 6.03±0.91#△▲□ 2.91±0.45#△▲□ 7.95±1.18#△▲□

3.5 各組腎組織Fas/Caspase-8通路蛋白水平比較

見圖3、表4。

表4 各組腎組織Fas/Caspase-8通路蛋白水平比較（±s，n= 8）

表4 各組腎組織Fas/Caspase-8通路蛋白水平比較（±s，n= 8）

注：與假手術組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與西地那非低劑量組比較，▲P＜0.05；與西地那非中劑量組比較，□P＜0.05

組別 Dose/（μg·mL-1） Fas Caspase-8假手術組 - 0.19±0.03 0.33±0.05模型組 - 1.06±0.16# 1.15±0.18#西地那非低劑量組 25 0.87±0.14#△ 0.87±0.15#△西地那非中劑量組 50 0.53±0.08#△▲ 0.65±0.09#△▲西地那非高劑量組 75 0.28±0.05#△▲□0.43±0.07#△▲□

圖3 各組腎組織Fas/Caspase-8通路蛋白水平比較

4 討論

血肌酐是人體肌肉代謝產物，其濃度變化能反映腎小球濾過率，濾過能力下降，則血肌酐濃度升高。腎功能損傷的關鍵因素之一是分泌大量尿蛋白，其中24 h尿蛋白檢測是測驗尿蛋白的有效方式[12]。與假手術組比較，模型組大鼠24 h尿蛋白、血肌酐水平均升高，但經低、中、高劑量西地那非藥物處理后，大鼠24 h尿蛋白、血肌酐水平降低。說明西地那非對RIRI腎功能具有一定保護作用。

病理狀態下氧自由基生成-清除平衡被破壞，細胞內SOD活性降低，細胞結構收到破壞，生成大量MDA，檢測細胞外SOD活性和MDA含量可以反映細胞氧化應激損傷程度[13-14]。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組腎組織SOD、GSH-px水平降低，MDA水平升高，當經低、中、高劑量西地那非藥物處理后，大鼠腎組織SOD、GSH-px水平升高，MDA水平降低。說明西地那非能夠對RIRI發揮保護作用，可能與抑制腎組織氧化應激反應有關。

腎小管細胞凋亡在RIRI發生發展過程中發揮著關鍵作用。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組腎小管細胞AI水平升高，當經低、中、高劑量西地那非藥物處理后，大鼠腎小管細胞AI水平降低。說明西地那非能夠對RIRI發揮保護作用，可能與抑制腎小管細胞氧化應激損傷有關。

氧化應激在細胞凋亡中有重要作用，研究[15]表明，活性氧簇可以促使線粒體釋放細胞色素C，激活Fas，進而激活Caspase-8，促使細胞發生凋亡。抑制Fas/Caspase-8通路活化可對RIRI發揮保護作用。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組腎組織Fas、Caspase-8蛋白水平升高，但經低、中、高劑量西地那非藥物處理后，大鼠腎組織Fas、Caspase-8蛋白水平降低。說明西地那非可能通過抑制RIRI大鼠腎組織氧化應激反應，抑制Fas/Caspase-8通路活化，進而抑制腎小管細胞凋亡，對RIRI發揮保護作用。

綜上所述，西地那非對RIRI大鼠腎臟發揮保護作用，可能是通過抑制RIRI大鼠腎組織氧化應激反應，抑制Fas/Caspase-8通路活化，進而抑制腎小管細胞凋亡實現的。本研究可為有效防治RIRI并改善腎移植患者預后提供一定理論依據，然而本研究并未能明確西地那非對Fas/Caspase-8通路的具體調控作用，后期應進行深入探討。