培哚普利對肥胖大鼠腸道微生態的影響

郭艷東，洪汝丹，汪艷蛟，張騰，馮月梅，張霓裳，錢映，楊早改，米飛，殷建忠1,

（1）保山中醫藥高等專科學校基礎醫學院，云南 保山 678000;2）昆明醫科大學公共衛生學院，云南 昆明 650500）

肥胖是多種慢性病的重要致病因素，已成為全球面臨的重大公共衛生問題[1]。WHO 數據顯示，1975 年以來，全世界的肥胖人數幾乎增加了3倍，現在全球18 歲以上的人有超過6.5 億肥胖和19億超重，其中男性超重、肥胖率均低于女性[2]。中國營養學會近日公布《中國肥胖預防與控制藍皮書》，我國約有4.4 億成年人超重，其中近1.3億人肥胖。有研究提示中國成人腹型肥胖率為31.5%，肥胖患病率為14%[3]。最新研究預測，至2030年，中國成人（≥18歲）超重/肥胖合并患病率將達到65.3%[4]。目前，肥胖病因未明，可能與腸道菌群紊亂等多種因素有關[5]。近年來，很多研究指出腸道菌群紊亂與肥胖等代謝性疾病相關[6-8]。本課題組前期研究結果提示云南高原偏寒地區漢族肥胖率為4.99%[9]，明顯低于全國水平，本研究推測肥胖發病率低的原因可能是因為高原偏寒環境改變了機體腸道菌群。培哚普利是第3 代血管緊張素轉換酶抑制劑（angiotensinconverting-enzyme inhibitor，ACEI），ACEI 是一種抑制血管緊張素轉化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）活性的化合物，ACE 參與脂肪細胞的生長和功能，ACE 催化血管緊張素I 生成血管緊張素II（AngII），AngII 可增加脂肪細胞中脂類合成和儲存[10]。大量的研究證實ACE 的表達和活性與肥胖有關[11-12]。有研究表明ACEI 治療可減輕體重[13-14]，但其對于肥胖的具體機制和對健康的影響還未明確。本課題主要是研究培哚普利干預肥胖發生的過程中腸道微生態的變化，探討培哚普利對肥胖的可能作用機制，以期為培哚普利的高效臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

4 周齡SPF 級雄性Wistar 大鼠；培哚普利叔丁胺片；普通飼料17 kcal% Fat；高脂飼料45kcal%FatD12451；DNA抽提試劑盒E.Z.N.A.?SoilDNAKit；瓊脂糖；FastPfu Polymerase；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit；建庫試劑盒；測序試劑盒。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與給藥將44 只SPF 級Wistar 大鼠用普通飼料適應性飼養1 周后，隨機分成正常組（10只）及高脂飲食組（34只），正常組（B）大鼠以普通飼料喂養，高脂飲食組以高脂飼料喂養5 周造模，[（造模組大鼠體質量-正常大鼠體質量）/正常大鼠體質量]×100%＞20%，判斷為肥胖模型制備成功。其中10 只造模失敗，予以剔除，將余下24 只按每組8 只隨機分為模型組（C）、培哚普利低（D）、高劑量組（E），藥物組連續給藥3周，每天1次，其他組給同容量的生理鹽水。培哚普利低、高劑量組給予培哚普利叔丁胺片0.4、2 mg/kg。給藥3周，每周稱體質量1 次。本研究通過昆明醫科大學醫學倫理委員會審核。

1.2.2 指標測定每周測大鼠體重及計算 Lee's指數，8 周后采血，低溫離心取血清保存于-20 ℃冰箱，TC（酶法）、TG（酶法）、HDL-C（直接法）、LDL-C（直接法）、UA（尿酶紫外速率法）、GLU（己糖激酶法）含量測定則通過ISO15189 國際認可的第3 方醫學實驗室昆明金域醫學檢驗所有限公司檢測并出具報告。

1.2.3 糞便收集8 周后，收集大鼠糞便34份，快速置于液氮中冷凍，然后轉入-80 ℃冰箱保存。所取樣本送往上海美吉生物醫藥科技有限公司進行16S rDNA v3-v4 區域測序分析。

測序分析過程如下：對送檢樣本分別進行總DNA 提取和檢測，然后進行 PCR 擴增、產物鑒定、純化、定量、文庫制備及庫檢，使用NEXTFLEXRapid DNA-Seq Kit構建Miseq文庫，利用Illumina 公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250平臺進行測序，使用UPARSE 軟件和RDP classifier 軟件對序列進行OTU 聚類和物種分類注釋，得到對應的物種信息和基于物種的豐度分布情況。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 培哚普利對大鼠體重及生化指標的影響

2.1.1 培哚普利對高脂飲食大鼠體重增重和Lee's指數的影響由表1 可知，終體重、體重增重、Lee's 指數在不同組間有統計學差異，Scheffe 法兩兩比較結果提示，與正常組比較，模型組大鼠終體重、體重增重、Lee's 指數升高（P＜0.01），說明模型建立成功；與模型組比較，其余各組大鼠終體重、體重增重均降低（P＜0.01，P＜0.05），與培哚普利低劑量組比較，培哚普利高劑量組大鼠終體重、體重增重均降低（P＜0.01，P＜0.05）。

表1 培哚普利對高脂飲食大鼠體重和Lee's 指數的影響（）Tab.1 Effects of perindopril on body weight and Lee's index in high-fat diet rats（）

表1 培哚普利對高脂飲食大鼠體重和Lee's 指數的影響（）Tab.1 Effects of perindopril on body weight and Lee's index in high-fat diet rats（）

與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與培哚普利低劑量組比較，@P＜0.05，@@P＜0.01。

2.1.2 培哚普利對大鼠血生化指標的影響由表2 可知，TC 和HDL-C 在不同組間有統計學差異，Scheffe 法兩兩比較結果提示，與正常組比較，模型組TC 水平降低（P＜0.05），模型組、培哚普利低劑量組、培哚普利高劑量組HDL-C 水平降低（P＜0.05，0.01）。

表2 培哚普利對對高脂飲食大鼠血生化指標的影響[（），mmol/L]Tab.2 Effects of perindopril on blood biochemical indexes in high-fat diet rats [（），mmol/L）

表2 培哚普利對對高脂飲食大鼠血生化指標的影響[（），mmol/L]Tab.2 Effects of perindopril on blood biochemical indexes in high-fat diet rats [（），mmol/L）

與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

2.2 培哚普利對大鼠腸道菌群多樣性的影響

Alpha 多樣性分析（表3），各組中的Coverage平均值為0.99，說明數據代表了樣品中99.00%以上的細菌類型，測序的深度和廣度都符合要求。與正常組比較，培哚普利低劑量組的Ace 指數和Chaol 指數升高，與模型組比較，培哚普利低劑量組的Shannon 指數、Simpson 指數、Ace 指數和Chaol 指數均有升高趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05），提示低劑量的培哚普利可能有提高大鼠腸道菌群物種豐富度的趨勢。

表3 培哚普利對大鼠腸道菌群Alpha 多樣性分析（）Tab.3 Analysis of Alpha diversity of rat intestinal flora by perindopril（）

表3 培哚普利對大鼠腸道菌群Alpha 多樣性分析（）Tab.3 Analysis of Alpha diversity of rat intestinal flora by perindopril（）

與正常組比較，#P＜0.05。

如圖1A 所示，通過分類操作單元（OTUs）韋恩圖，研究了不同組之間的OTU 組成的相似性和重疊性。全部樣本共689 個OTU，正常組、模型組、培哚普利低劑量組、培哚普利高劑量組的OTU 總數分別為561、592、619 和592，獨有的OTU 為22、9、14 和4。與正常組相比，模型組OTU 總數增加了5.53%（正常組：561；模型組：592），培哚普利低劑量組OTU 總數增加了10.34%（正常組：561；培哚普利低劑量組：619），培哚普利高劑量組OTU 總數增加了5.53%（正常組：561；培哚普利低劑量組：592）；與模型組相比，培哚普利低劑量組OTU 總數增加了4.56%（模型組：592；培哚普利低劑量組：619），但是，培哚普利高劑量組沒有增加（模型組：592；培哚普利高劑量組：592）。

圖1 培哚普利對大鼠腸道菌群的多樣性分析Fig.1 Diversity analysis of perindopril on the intestinal flora of rats

Beta-多樣性分析是OTUs 的豐富度信息比較腸道微生物群落之間的相似度程度。如圖1B 所示，正常組與模型組分布距離較遠，說明群落結構的分布明顯不同。培哚普利低劑量組與模型組沒有重疊，說明2 組的群落結構具有一定的差異性。

2.3 培哚普利對大鼠腸道菌群物種組成的影響及差異分析

2.3.1 門水平物種組成及差異分析由圖2A 可知，在所有的大鼠腸道菌群中，優勢物種除了有各組大鼠腸道菌群的優勢物種還有變形菌門（Proteobacteria）。由圖2B 可知，群落柱形圖可解釋各組樣本的優勢物種及其相對豐度，各組大鼠腸道菌群的優勢物種主要歸屬為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、脫硫桿菌門（Desulfobacterota）、放線菌門（Actinobacteriota）和彎曲桿菌門（Campilobacterota）。由表4 可知，各組大鼠腸道菌群在門水平物種組成有顯著差異（P＜0.05）。與模型組比較，正常組厚壁菌門物種組成顯著升高（P＜0.05），脫硫桿菌門和彎曲桿菌門物種組成顯著降低（P＜0.0.），培哚普利低劑量組厚壁菌門物種組成顯著降低（P＜0.01），培哚普利高劑量組放線菌門物種組成顯著升高（P＜0.01）。

表4 各組大鼠糞便在門水平上的相對豐度（%/，正常組n=10，其余組n=8）Tab.4 Relative abundance of rat feces at phylum level in each group（%/，normal group n=10，other groups n=8）

表4 各組大鼠糞便在門水平上的相對豐度（%/，正常組n=10，其余組n=8）Tab.4 Relative abundance of rat feces at phylum level in each group（%/，normal group n=10，other groups n=8）

與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

圖2 各組大鼠腸道菌群門水平的優勢物種及其相對豐度Fig.2 Predominant species and their relative abundance at the phylum level of rat gut flora in each group

2.3.2 屬水平物種組成及差異分析如圖3A 所示，所有大鼠腸道菌群在屬水平的優勢物種主要有29 種（以群落相對豐度≥0.01 為篩選條件），如圖3B 所示，各組大鼠腸道菌群在屬水平的優勢物種主要有18種，如圖3C 所示，各組大鼠的腸道菌群在norank_f__Muribaculaceae、擬普雷沃菌屬（Alloprevotella）、Lachnospiraceae_NK4A136_group等15 個物種組成上具有顯著差異（P＜0.05、0.01）。與模型組比較，正常組擬普雷沃菌屬物種組成顯著升高（P＜0.05），螺桿菌屬物種組成顯著降低（P＜0.01），培哚普利低劑量組擬普雷沃菌屬、NK4A214_group、no_rank_f__Erysipelotrichaceae、norank_f__Eubacterium_coprostanoligenes_group物種組成顯著升高（P＜0.05、0.01），培哚普利高劑量組norank_f__Erysipelotrichaceae、Enterorhabdus、葡萄球菌屬物種組成顯著升高（P＜0.01）。

圖3 各組大鼠腸道菌群屬水平組成Fig.3 Level composition of the intestinal flora of rats in each group

2.4 大鼠腸道菌群與Lee's 指數、血生化指標的相關性分析

通過spearman 相關系數分析各組大鼠腸道菌群與Lee's index、血生化指標相關性。如圖4 所示，在屬水平上（取屬水平豐度前50），乳酸球菌屬與Lee's index、GLU 呈正相關（P＜0.05、0.001），與HDL-C 呈負相關（P＜0.01）；屎豆屬菌與HDLC 呈正相關（P＜0.01），與 Lee's index 呈負相關（P＜0.01）；Erysipelatoclostridium與Lee's index 呈正相關（P＜0.05）；norank_f__Eubacterium_coprostanoligenes_group、norank_f__Erysipelotrichaceae與 Lee's index 呈負相關（P＜0.05、0.001）；瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、Eubacterium xylanophilum-group與TG 呈正相關（P＜0.05）；考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）與LDL-C 呈負相關（P＜0.05）；Allobaculum與TG呈負相關（P＜0.05）；布勞特氏菌屬（Blautia）、Candidatus_Stoquefichus與UA 呈負相關（P＜0.05）。以上結果顯示，大鼠腸道菌群變化與Lee's 指數、血生化指標異常存在相關性。

圖4 大鼠腸道菌群與Lee's 指數、血生化指標Spearman 相關性分析Fig.4 Spearman correlation analysis of rat intestinal flora with Lee's index and blood biochemical index

3 討論

隨著人們膳食習慣的變化，高脂飲食逐漸增加，其過量攝入會導致脂肪蓄積從而形成肥胖[15]。脂肪過多會增加慢病的患病率和死亡率[16]。近年來，人們發現腸道菌群在肥胖的發生和發展中發揮舉足輕重的作用[17-18]。本研究表明，即使灌胃期間仍然給予高脂膳食，和模型組相比，培哚普利也顯著抑制大鼠體重增加，這可能是因為培哚普利通過改善腸道菌群結構來抑制體重增加。

16S rDNA 基因擴增測序的分析結果表明，培哚普利低劑量組與模型組的群落結構具有一定的差異性，與模型組相比，培哚普利低劑量組OTU總數增加了4.56%，說明培哚普利可能提高了大鼠腸道菌群的多樣性；在門水平上，低劑量的培哚普利能顯著降低厚壁菌門物種組成，有升高擬桿菌門的趨勢。目前，大量研究證實，“肥胖菌群”特征是厚壁菌門增，擬桿菌門降[19]，擬桿菌門可發酵膳食纖維產生短鏈脂肪酸，厚壁菌門從食物中獲取能量，并以脂肪組織的形式儲存[20]，培哚普利高劑量組放線菌門物種組成顯著升高，Da Silva等[21]研究結果提示放線菌門和雙歧桿菌屬與BMI 呈負相關；從屬水平來看，低劑量的培哚普利能顯著提高擬普雷沃菌屬、NK4A214_group、no_rank_f__Erysipelotrichaceae、norank_f__Eubacterium_coprostanoligenes_group的物種組成，有研究指出擬普雷沃菌屬可通過膳食纖維發酵短鏈脂肪酸[22]。短鏈脂肪酸可促使胰高血糖素樣肽的釋放，從而促進胰島素的分泌，提高機體胰島素敏感性，減少脂肪沉積[23-24]。

總之，本研究發現培哚普利能夠降低肥胖大鼠體重，這可能與培哚普利改變腸道菌群有關。經過培哚普利干預后，放線菌門和擬普雷沃菌屬升高，厚壁菌門降低，這可能是培哚普利發揮抑制肥胖的重要生理基礎。同時，本研究存在一定的局限性，培哚普利的濃度只有高、低劑量，后期研究需進一步考察不同濃度梯度對大鼠腸道菌群的調節作用。