ROR1 在肺腺癌組織中的表達與氣腔播散相關性

趙華君，潘國慶，唐瑩，王智園，趙曉瑋，陀曉宇

（1）昆明醫科大學附屬精神衛生中心，云南 昆明 650224;2）昆明醫科大學第一附屬醫院病理科，云南 昆明 650032;3）昆明醫科大學電鏡室,云南 昆明 650500）

肺腺癌是世界范圍最常見的惡性腫瘤之一，近年來在我國發病率有上升趨勢，雖然靶向治療等新型治療模式取得長足發展，肺腺癌的療效得到了顯著提高，但肺腺癌仍是病死率最高的惡性腫瘤之一[1]。肺腺癌的侵襲、轉移是導致患者生存率低的最主要因素[2]，傳統肺腺癌的侵襲轉移途徑包括：血管、淋巴管侵犯及胸膜侵犯[3]。在《WHO（2015）肺腫瘤病理診斷指南》中正式提出并命名了一種新的肺癌侵襲模式：氣腔播散或氣道播散（spread through air space，STAS），定義為呈微乳頭狀、簇狀、實性的腫瘤巢或單個散在腫瘤細胞脫離主瘤體進入周圍肺泡腔中播散，最終形成癌島及衛星癌灶，導致腫瘤進展[4]。到目前為止，還沒有任何被廣泛接受的理論來解釋STAS 的發生、發展機制，但現有研究已經證實STAS 是導致肺腺癌患者術后復發、進展的獨立高危因素[5]。

受體酪氨酸激酶樣孤兒受體（receptor tyrosine kinase-like orphan rectetpor 1，ROR1）是一類膜受體，屬于Ⅰ型受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）家族，主要包括ROR1 和ROR2，其中ROR1 主要通過參與細胞內與細胞間信號傳導，實現調節細胞代謝、增殖、凋亡、分化、遷移、轉移等功能[6-8]。近年來國內外研究發現，ROR1 在正常、分化成熟的組織中幾乎不表達，但在包括乳腺癌、結直腸癌、卵巢癌、惡性黑色素瘤、淋巴造血系統腫瘤等多種腫瘤中高表達[9-13]，而且表達水平與腫瘤惡性程度、侵襲性及轉移等生物學行為存在密切關系[6]。

目前針對STAS 的研究主要集中在肺腺癌的臨床病理特征及預后影響等方面，研究對象主要為肺葉或亞肺葉（肺段）切除術后的腫瘤標本。由于STAS 僅能在術后才能確診，術前或術中冰凍判斷STAS 較為困難[14]。本文結合肺腺癌的病理組織亞型，通過檢測ROR1 蛋白在肺腺癌中的表達水平，探討ROR1 作為STAS 發生預測指標的價值，初步探討其潛在機制，為臨床在術前輔助判斷肺腺癌STAS 狀態，進一步制定針對性治療方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集昆明醫科大學第一附屬醫院病理科2017年6 月至2022 年1 月手術切除肺腺癌蠟塊標本618例，其中男性242例（39.2%），女 性376 例（60.8%），年齡29～81歲，中位年齡59 歲。原位癌、微浸潤性腺癌及術前接受放、化療者均排除。本研究通過昆明醫科大學第一附屬醫院醫學倫理審核委員會審核。通過復習病理切片，按WHO肺腫瘤病理診斷指南[4]標準以主要腫瘤病理亞型，將肺腺癌分為高分化（貼壁型），中分化（腺泡型、乳頭型），低分化（微乳頭型、實體型），同時觀察腫瘤神經侵犯、脈管侵犯、胸膜侵犯情況，由2 位經驗豐富的病理醫生觀察是否存在STAS，記錄STAS 腫瘤細胞數目、形態、分布，見圖1。

圖1 肺腺癌病理學亞型Fig.1 Subtypes of lung adenocarcinoma

1.2 實驗方法

實驗標本均經中性福爾馬林固定，采用石蠟包埋，切片后，行HE 及EnVision 兩步法免疫組化染色（IHC）。ROR1 蛋白抗體購自美國Thermo Fisher 公司；二抗購自邁新生物技術公司；陰性對照采用PBS 代替一抗。

1.3 結果判斷

1.3.1 STAS 判斷與分組依據WHO 定義判斷是否發生STAS，記錄STAS 類型及細胞數量，按照病理學形態分為3類[4,15]：（1）腫瘤周圍肺泡腔內見呈微乳頭或簇狀腫瘤細胞巢；（2）腫瘤周圍肺泡腔內見實性小巢狀腫瘤細胞或腫瘤島；（3）腫瘤周圍肺泡腔內見散在單個腫瘤細胞；根據STAS腫瘤細胞數量進一步分組[16-17]為：無STAS 組（未觀察到STAS）、低STAS 組（STAS 腫瘤細胞數量為1～4個）、高STAS 組（STAS 腫瘤細胞數量≥5個），見圖2。

圖2 STAS 病理形態與分組Fig.2 Pathological morphology and grouping of STAS

1.3.2 免疫組化結果判斷ROR1 蛋白免疫組化染色著色定位于腫瘤細胞質與細胞膜（染色強度判斷需對比背景非特異著色），根據陽性染色強度與陽性細胞比例采用半定量積分法[11]判定結果：（1）染色強度以多數細胞呈現的染色特性計分：無著色為0分，光鏡可識別的黃色（弱陽性）為1分，棕黃色（中陽性）為2分，棕褐色（強陽性）為3 分；（2）計算陽性腫瘤細胞百分率并評分：0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，75%為4 分。兩項得分相乘，得分≥4分，判斷為陽性；＜4 分判斷為陰性，見圖3。

圖3 ROR1 在肺腺癌中的表達（IHC ×400）Fig.3 Expression of ROR1 in lung adenocarcinoma（IHC ×400）

1.4 統計學處理

應用SPSS21.0 統計軟件，采用χ2檢驗分析，表1 中組織學形態與STAS 關系、表2、表3 均采用列聯表分析，計算Pearson 卡方值。表1 中除上述表格外的其他表均采用一般四格表卡方檢驗計算Pearson 卡方值，再比較P值。采用χ2檢驗分析比較ROR1 在不同肺腺癌病理亞型的表達水平，并分析ROR1 在不同STAS 分組中表達的差異。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 STAS 與肺腺癌亞型及臨床病理特征的關系

肺腺癌618例，STAS陽性率為31.2%（193/618），通過分析發現STAS 的發生與患者性別、年齡無關（P＞0.05）；有吸煙史的患者具有更高的STAS 發生率（P＜0.001）；腫瘤直徑＞2.5 cm組肺腺癌STAS 發生率為72.2%高于直徑≤2.5 cm組（P＜0.001）;進一步分析各亞型肺腺癌的STAS陽性率發現：低分化肺腺癌（微乳頭型、實體型肺腺癌，STAS 陽性率分別為71.0%、64.7%），高于中分化肺腺癌（腺泡型、乳頭型，STAS 陽性率分別為26.7%、29.1%），高分化的貼壁型肺腺癌中未發現STAS 現象（P＜0.001）。通過分析臨床病理特征與STAS 發生的相關性發現，STAS 的發生與其它肺腺癌侵襲性生物學行為如：淋巴結轉移、神經侵犯、脈管侵犯及胸膜侵犯相關（P＜0.001），見表1。

表1 STAS 與肺腺癌臨床病理學特征的關系 [n（%）]Tab.1 Relationship between STAS and clinicopathological features of lung adenocarcinoma[n（%）]

2.2 ROR1 在不同亞型肺腺癌中的表達

采用免疫組化法檢測618 例肺腺癌ROR1 表達情況，通過觀察陽性率發現：貼壁型（9.5%）低于腺泡型與乳頭型（分別為28.6%、33.1%），而微乳頭型與實體型肺腺癌（分別為79.7%、80.4%）ROR1 表達率高于其余各亞型肺腺癌，見表2、圖4。

圖4 不同病理亞型肺腺癌STAS 發生率與ROR1 表達率的關系Fig.4 The relationship between the incidence of STAS and ROR1 expression in different pathological subtypes of lung adenocarcinoma

表2 ROR1 在不同亞型肺腺癌中的表達 [n（%）]Tab.2 Expression of ROR1 in different subtypes of lung adenocarcinoma[n（%）]

2.3 ROR1 在不同STAS 分組中的表達

通過比較無STAS 組（未觀察到STAS，425例，68.8%），低STAS組（STAS數量為1～4個，109例，17.6%），高STAS組（STAS數量≥5個，84例，13.6%），3 組ROR1 表達率分別為10.6%、88.0%、94.1%，見表3、圖5；且低、高STAS 組中STAS 腫瘤細胞與主瘤體ROR1 表達強度基本一致，見圖6。

圖5 不同STAS 分組ROR1 陽性率Fig.5 ROR1 positive rate in different STAS groups

圖6 ROR1 在STAS 陽性肺腺癌中的表達Fig.6 ROR1 expression in STAS positive lung adenocarcinoma

表3 ROR1 在不同STAS 分組中的表達 [n（%）]Tab.3 ROR1 expression in different STAS groups[n（%）]

3 討論

本研究結果顯示在618 例肺腺癌中STAS 陽性率為31.2%，有吸煙史、腫瘤直徑＞2.5 cm 的肺腺癌具有更高的STAS 陽性率，與國內外文獻報道接近[18]，其中低分化的微乳頭型與實體型肺腺癌STAS 陽性率分別為71.0%、64.7%，高于中分化肺腺癌（腺泡型、乳頭型，STAS 陽性率分別為26.7%、29.1%）；而在貼壁型肺腺癌中未發現STAS。這一結果提示，STAS 的發生主要取決于腫瘤的分化程度，并且與神經侵犯、脈管侵犯、胸膜侵犯一樣提示腫瘤具有更高的侵襲性生物學行為。

通過比較不同亞型肺腺癌ROR1 的表達水平后發現，ROR1 在微乳頭型與實體型肺腺癌（分別為79.7%、80.4%）中的表達高于其余各組織學類型組，這一結果顯示，ROR1 高表達于低分化肺腺癌；依據STAS 狀態進一步分組后發現低STAS 組、高STAS 組的ROR1 表達率分別為88.0%、94.1%，高于無STAS 組（10.6%），說明ROR1 高表達于STAS 陽性肺腺癌。

總結本研究結果，ROR1 高表達于低分化、高侵襲性的肺腺癌，并提示高STAS 發生率。因此推測ROR1 在肺腺癌組織中的高表達可能與肺腺癌的發生發展以及STAS 的發生存在密切關系，但病理生理學過程尚不明確。依據現有相關文獻報道，其潛在機制可能主要有以下幾方面：（1）ROR1 過表達誘導肺腺癌細胞EMT，從而促進STAS 發生[19-20]。EMT（上皮-間質轉化）是指上皮細胞通過程序轉化為表現出間質細胞特征的病理生理學過程。通過EMT，腫瘤細胞極性喪失，粘附性下降，同時具有促進腫瘤細胞的遷移、侵襲、抗凋亡和降解細胞外基質的能力[21]。雖然STAS是肺癌特有的一種浸潤生長模式，但在本研究中發現STAS 的發生與淋巴結轉移、神經侵犯、脈管侵犯及胸膜侵犯腫瘤侵襲性生物學行為相關，這些侵襲性生長現象均是在腫瘤粘附性下降、遷移能力增強的前提下發生的。目前，在結腸癌、乳腺癌的研究中已經發現ROR1 高表達具有促進腫瘤細胞EMT 作用[13,22]，因此推測，ROR1 高表達的肺腺癌發生EMT 導致腫瘤細胞粘附性下降，脫離主瘤體播散進入到周圍肺泡腔內，這可能是發生STAS 的直接原因與關鍵啟動步驟；（2）ROR1 高表達促進肺腺癌細胞高增殖、高侵襲性，導致STAS 發生。本研究發現ROR1 高表達于分化程度低，侵襲、轉移能力強的肺腺癌亞型中，在國內外研究中也發現ROR1 高表達于分化差的結腸癌、宮頸癌、乳腺癌等腫瘤中并具有促腫瘤增殖、侵襲的作用[23-24]，在一項結腸癌研究中發現通過下調ROR1 表達能夠降低腫瘤細胞增殖與遷移能力[22]。因此，ROR1 過表達可能促進肺腺癌細胞的高增殖、高侵襲性，這也是導致STAS發生的重要因素。

自從2015 年STAS 被WHO 列為肺癌浸潤標準以來，引起臨床病理學的高度關注[25-27]。但到目前為止，還沒有被廣泛接受的理論來解釋STAS 發生、發展機制。通過本研究發現，ROR1高表達的肺腺癌具有較高的STAS 陽性率，提示腫瘤差分化及高侵襲性。因此ROR1 有望成為臨床肺腺癌診斷的重要生物學標志物，特別是通過在肺癌術前檢測ROR1 表達水平，可以輔助判斷腫瘤惡性程度，并預測肺腺癌STAS 發生概率，為臨床針對患者制定個體化的手術方式與術后治療方案提供參考依據，從而改善患者預后。ROR1 在STAS 陽性肺腺癌過表達現象，其病理生理學機制還有待進一步深入研究；但這一發現，也為將來以ROR1 為靶點治療STAS 陽性肺癌提供了新的研究方向。