全外顯子家系測序在WDR35基因復合雜合變異導致SRPS-5胎兒產前診斷中的價值

趙旭亮， 田瑞霞， 施友文， 俞 敏， 焦鎏鎏， 朱復希

（1.安徽醫科大學第一附屬醫院婦產科生殖醫學中心，安徽 合肥 230022；2.中國人民解放軍聯勤保障部隊第901醫院婦產科，安徽 合肥 230031；3.中國人民解放軍聯勤保障部隊第901醫院影像科，安徽 合肥 230031）

骨骼纖毛類疾病是一類以骨骼系統異常為主要表現的罕見疾病，是由調控初級纖毛結構或功能的基因缺陷導致的，包括短肋-多指綜合征（short-rib polydactyly syndrome，SRPS）、軟骨外胚層發育不良癥（chondroectodermal dysplasia，EVC）、窒息性胸廓營養不良（asphyxiating thoracic dysplasia，ATD）或Jeune綜合征、Sensenbrenner綜合征和顱骨外胚層發育不良（cranioectodermal dysplasia，CED），其中圍產期致死性SRPS的病情最為嚴重[1]。WDR35基因缺陷可導致伴或不伴多指（趾）畸形短肋胸椎發育不良7型（short-rib thoracic dysplasia 7，SRTD7；OMIM#614091），又被稱為短肋-多指綜合征5型（SRPS-5），屬于SRPS中較為罕見的亞型。SRPS主要表現為胸廓狹窄、伴四肢長骨明顯短小及多指（趾）畸形，不同亞型間臨床表現常有重疊，因此不易鑒別[2-3]。本研究采用全外顯子家系測序（trio-whole exome sequencing，Trio-WES）診斷1例SRPS-5引產兒，并分析其臨床特征和遺傳學特點。

1 材料和方法

1.1 研究對象

引產兒母親30歲，孕4產2，本次妊娠為宮內孕、單胎。否認近親婚配，體健，且無不良嗜好，否認孕前特殊病史及圍孕期因素暴露史。曾有2次胚胎停育史，1次引產史（孕足月因胎兒畸形考慮四肢短小引產，具體情況不詳）。本次妊娠再次因胎兒“四肢短小”于孕22+3周就診于中國人民解放軍聯勤保障部隊第901醫院。產前超聲檢查示胎兒頸后透明帶厚度1.2 mm，雙頂徑52 mm（孕22周水平），頭圍193 mm（孕21+4周水平），腹圍172 mm（孕22+2周水平），股骨長19 mm（孕15+4周水平），肱骨長22 mm（孕16+5周水平），脛骨長16 mm，足長36 mm，胎兒心率151次/min，心率齊。胎兒長骨明顯較短，且骨干彎曲，股骨干骺端粗大，呈“電話聽筒”狀；胸腔狹窄且胸圍較小，心胸比值為0.43，肋骨短且雙肺受壓變??；腹部膨隆，胸腹移行處有分界，移行處腹側增大。超聲診斷胎兒骨骼發育不良，結合胎兒母親不良妊娠史，考慮致死性侏儒Ⅰ型。胎兒母親及其家屬選擇于孕23周引產終止妊娠。引產兒體征與超聲結果相符。電子計算機斷層掃描（computed tomography，CT）三維重建提示長骨及骨干發育不良，肋骨短且胸腔狹窄，但頭顱、手及足部發育正常。見圖1。

圖1 本例胎兒引產前、后的影像學檢查結果

1.2 方法

1.2.1 基因檢測 本研究經中國人民解放軍聯勤保障部隊第901醫院倫理委員會審批通過（倫理申請號：202106002），孕婦及其家屬簽署知情同意書。取引產兒皮膚組織約2 g，置于RNAlater保護管中，同時采用乙二胺四乙酸抗凝管采集其父母外周血3 mL。行全外顯子家系測序（trio-whole exome sequencing，Trio-WES），根據基因組提取試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）說明書要求提取DNA。將目標區域DNA片段進行富集，構建覆蓋人類基因組全外顯子文庫，采用NovaSeq 6000測序儀（美國Illumina公司）對其進行高通量測序，目標序列覆蓋度≥99%。

1.2.2 數據處理與位點驗證 測序數據經質控過濾后，將序列與GRch37/hg19參考基因組進行比對，對在各數據庫（dbSNP、千人基因組及ExAC）中篩選出的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點、插入及缺失變異進行檢索，查看其在正常人群中的分布頻率。采用SIFT（http：//provean.jcvi.org/index.php）、PolyPhen-2（http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）及Mutation Taster（https：//www.mutationtaster.org/）蛋白結構預測軟件對錯義突變進行危害性分析。根據美國醫學遺傳學和基因組學學會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）相關指南[4]進行變異位點評級。采用Sanger測序驗證WDR35基因可疑致病變異位點，采用3730XL測序儀（美國ABI公司）對擴增產物進行測序，并采用DNASTAR 5.0軟件（美國DNASTAR公司）進行分析。WDR35基因缺失驗證：在缺失區域上、下游各設計1個對照擴增子，常染色體與X染色體各設計1個對照擴增子，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）進行DNA相對定量分析。

1.2.3 變異保守性分析及結構預測 在美國國立生物技術信息中心數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/）搜索WDR35蛋白序列（NM_001006657），采用Mega 7.0軟件（新西蘭Mega有限公司）對變異位點進行保守性分析，并進行多物種同源比對。采用Swiss-Model在線平臺（https：//swissmodel.expasy.org/）查詢與WDR35蛋白序列相似的三維晶體結構，以酵母β-COP結構為模板（PDB編號：3mkqA）[5]，采用DeepView軟件（瑞士生物信息研究院）進行可視化分析，在正常WDR35蛋白三維模型上對定點突變位點（p.Val267Met）進行局部展示。

2 結果

2.1 基因檢測結果

Trio-WES結果顯示，胎兒WDR35基因發生復合雜合變異，分別為父親攜帶的c.799G＞A/p.Val267Met雜合變異和母親攜帶的chr2：20151176-20151245雜合缺失，dbSNP數據庫、千人基因組數據庫和ExAC數據庫均未收錄這2個變異。Sanger測序結果顯示存在c.799G＞A/p.Val267Met變異。RT-qPCR結果顯示母親攜帶chr2：20151176-20151245雜合缺失，該缺失區域包含WDR35基因第14號外顯子序列。引產兒家系圖見圖2。引產兒及其父母WDR35基因變異分析結果見圖3。

圖2 引產兒家系圖

圖3 先證者（引產兒）及其父母WDR35基因變異分析

采用SIFT、PolyPhen-2及Mutation Taster在線分析軟件對c.799G＞A/p.Val267Met的生物危害性進行預測分析，結果分別為0.002（damaging）、0.791（possibly damaging）、1（disease causing），提示變異可能影響蛋白功能。檢索HGMD及PubMed數據庫，未發現關于該變異的報道，屬于WDR35基因新變異。根據ACMG指南，將c.799G＞A/p.Val267Met評級為可能致?。╨ike pathogenic），評級證據為PM1+PM2+PM3+PP3。chr2：20151176-20151245雜合缺失為功能缺失型（loss of function，LOF）變異，可能導致基因功能喪失，ACMG將該變異評級為可能致病（like pathogenic），評級證據為PVS1+PM2。

2.2 同源性比對和結構預測結果

同源性比對結果顯示，WDR35蛋白Val267在不同物種之間高度保守。見圖4。

圖4 不同物種之間WDR35蛋白的同源性分析

通過Swiss-Model在線平臺對WDR35蛋白同源進行建模，結果顯示，WDR35蛋白Val267位于WD40蛋白N'-端7個緊密相連的β-螺旋槳狀結構域，該結構域起著蛋白識別及運輸等功能。當p.Val267Met發生變異，即與Val286、Gln287形成額外氫鍵時，可能導致局部空間改變。見圖5。

圖5 蛋白結構預測分析結果

3 討論

短肋胸椎發育不良（short-rib thoracic dysplasia，SRTD）是以肋骨短小及胸廓狹窄為主要表型的一類綜合征，可合并多指（趾）畸形等。伴或不伴多指（趾）畸形SRTD有22種亞型（www.omim.org/phenotypicSeries/PS208500）。SRTD分類主要為SRPS、ATD及Mainzer-Saldino綜合征（OMIM#266920）等[6]，其中SRPS由初級纖毛功能缺陷和/或纖毛蛋白調節的細胞信號通路受損所致[7]，根據不同致病基因共分為5種亞型，WDR35基因變異引起的SRPS-5于2011年被首次報道，該亞型為一種常染色體隱性遺傳疾病，其主要臨床特征為嚴重的四肢短小伴彎曲、窄胸及多指（趾）畸形、髖臼頂呈“三叉戟”狀，非骨骼系統表型包括唇腭裂及其他器官畸形，如腎囊腫及偏側性缺陷[2，4]。本例SRPS-5胎兒具有四肢長骨明顯短小且彎曲，窄胸伴肺發育不良等SRPS典型臨床特征。另外，在胎兒母親既往孕史中，有1次因產前超聲提示胎兒四肢短小而引產的情況，具體臨床信息不詳，可能同樣因WDR35基因缺陷所致。

值得注意的是，WDR35基因缺陷除可導致SRPS-5外，也是CED-2的致病基因。CED-2患兒出生后即可觀察到其特殊面容，包括額頭隆起、雙側顳部狹窄、低耳位或向后旋轉的外耳廓、內眥褶、小下頜及鼻孔前傾等。由于變異導致外胚層發育受限，CED-2患兒主要臨床特征為顱縫早閉、短指及牙齒、頭發、指甲等外胚層組織異常，雖也表現為四肢短?。ㄓ绕涫请殴牵┖托乩M窄，但嚴重程度明顯弱于SRPS-5，且有非胚胎期致死的特征[8]。SRPS-5患兒出現嚴重表型可能與WDR35基因發生LOF變異有關，既往報道的SRPS-5病例中，至少有1個WDR35等位基因發生移碼變異或非編碼區變異導致的轉錄異常[5，9-10]。然而，CED-2患者WDR35基因多數為錯義變異導致蛋白功能受損[11-14]，由于該基因變異相關報道較為罕見，因此能否利用變異類型鑒別2種疾病的效能，仍需更多隊列研究進行驗證。

根據致病基因可將SRPS分為5種亞型，每種亞型的表型相似，通過超聲進行產前診斷具有一定的困難，每種亞型均可導致特定疾病。由DYNC2H1基因變異導致的SRPS-1或SRPS-3又被稱為Saldino-Noonan綜合征或Verma-Naumoff綜合征（OMIM#613091），是最常見的SRPS亞型，約占SRPS患者數的50%[8]。SRPS-1的特征為肢體極度短?。挔钪w）、胸廓狹窄、多指（趾）畸形、肩胛骨發育不全和多器官受累等，是最嚴重的SRPS亞型；SRPS-3與SRPS-1表型相似，患兒四肢短小、胸廓狹窄、顱底短缺、前額突出和枕部平坦的特征較明顯[15-16]。NEK1基因變異導致的SRPS-2又被稱為Majewski綜合征（OMIM#263520），患兒特征為長骨干骺端光滑，脛骨較腓骨短，多指（趾）畸形較為普遍[17]。IFT122基因變異導致的SRPS-4又被稱為Beemer-Langer綜合征（OMIM#269860），與SRPS-2表型相似，均可表現出長骨短且干骺端光滑[18]，長骨嚴重彎曲（特別是橈骨與尺骨）、腓骨纖薄、小髂骨也是其臨床特征[3]。綜合不同亞型的臨床表型可以看出，SRPS最顯著的臨床特征為肋骨短伴四肢長骨明顯短小，并可合并多指（趾）畸形，累及多器官。

SRPS的發生主要由細胞纖毛形成及功能缺陷導致，細胞纖毛內轉運蛋白（intraflagellar transport，IFT）對建立和維持纖毛結構至關重要。IFT轉運過程需要三磷酸腺苷參與，并由大型多蛋白復合物IFT-A和IFT-B控制，WDR35基因編碼IFT-A復合體核心區域的IFT121蛋白（另外2個蛋白分別為IFT140、IFT144）[3]，因此WDR35基因缺陷會干擾下游IFT43的穩定性，從而破壞生長板軟骨細胞的有序增殖和分化，對軟骨內成骨與礦化產生嚴重影響[19]。WDR35蛋白包括N'-端由7個緊密連接的β-螺旋槳狀結構組成的結構域（WD40/WD40樣重復結構域），具有細胞內識別、結合及運輸蛋白的生物功能，而在C'-端為1個TRP樣重復結構域[10，20]。本例引產兒WDR35基因發生復合雜合變異，其中1個源自父親的錯義變異（c.799G＞A/p.Val267Met），位于WD40樣重復結構域，通過蛋白結構預測該變異可導致局部生成額外氫鍵，進而可能影響該結構域的生物功能。MILL等[5]報道了1例具有顯著短肢、軸后多指畸形及特殊面容表型的SRPS-5胎兒，胎兒WDR35基因的1個錯義突變位點同樣出現在高度保守的WD40樣重復結構域。提示該結構域功能被破壞可能會導致更嚴重的疾病表型，但由于目前關于SRPS-5患兒產前研究的報道較少，因此仍需明確其基因型-表型的關聯性。

綜上所述，產前超聲檢查雖可識別胎兒發育異常等問題，但許多疾病表型在妊娠后期或產后逐漸發生變化，增加了通過超聲進行產前診斷的難度。SRPS不僅在不同亞型間表型相似，而且也與EVC、CED等其他軟骨發育不良疾病的產前超聲影像特征存在廣泛的表型重疊，若不進行基因檢測，幾乎難以精確診斷。而全外顯子基因測序有助于診斷胎兒期疾病。ACMG于2020年發布了胎兒全外顯子測序在產前診斷中的應用指南，明確指出，當胎兒超聲檢查結果異常，并在核型和染色體微陣列檢測未見異常的情況下，建議進行Trio-WES[21]。隨著測序技術的不斷發展和臨床數據的不斷積累，胎兒全外顯子測序技術必將廣泛應用于產前精準診斷，并發揮關鍵作用。