α-地中海貧血和β-地中海貧血基因突變異尾雙鏈熒光探針雜交法的建立及應用評價

李仁強， 羅俊峰， 陳云弟

（上海閱爾基因技術有限公司技術研發部，上海 200433）

地中海貧血（簡稱地貧）是由于珠蛋白基因發生缺陷，導致1種或幾種珠蛋白肽鏈不能合成或合成減少，鏈結構正常但比例失衡的遺傳性溶血性血紅蛋白病。地貧是常見的遺傳病，主要分布于地中海、中東、印度、東南亞和非洲地區，全球地貧基因攜帶者近2億[1-2]。地貧也是我國南方地區常見的、危害較大的遺傳病之一，其臨床異質性較大，從無臨床表現到嚴重貧血，甚至死亡；尤其是β-地貧，患兒一般不會在出生時或出生后很快出現貧血等臨床表現。準確、有效的基因檢測技術對于地貧的及時診斷至關重要。本研究擬建立一種基于異尾雙鏈熒光探針技術的新的檢測方法，通過3管反應即可檢測常見的3種α-地貧非缺失突變和8種β-地貧點突變，同時對該方法的檢測性能進行評價。

1 材料和方法

1.1 樣本制備

從UCSC數據庫（http：//genome.ucsc.edu/）獲取α-地貧基因簇和β-地貧基因簇序列[3]，從人類血紅蛋白數據庫（https：//globin.bx.psu.edu/hbvar/）[4]獲取α-地貧點突變和β-地貧點突變序列，并據此設計突變型質粒，將質粒干粉[生工生物工程（上海）股份有限公司]進行離心處理后，用TE緩沖液梯度稀釋至2 000拷貝/μL。將正常樣本基因組DNA（上海閱爾基因技術有限公司）稀釋至7 ng/μL（約2 000拷貝/μL）。將突變型質粒與正常樣本基因組DNA按1∶1（V∶V）混合，獲得模擬雜合突變樣本。

每套地貧核酸檢測國家參考品（貨號360014-201701，中國食品藥品檢定研究院）為32份，其中29份為點突變、缺失突變參考品，3份為無突變正常參考品。

在上海閱爾基因技術有限公司樣本庫中選取已知地貧基因型的臨床樣本200份，采用核酸提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取樣本DNA，用NanoDrop 2000分光光度計（美國ThermoFisher Scientific公司）測定DNA濃度和純度，嚴格按試劑盒說明書要求操作。

1.2 異尾雙鏈熒光探針法的實驗設計

1.2.1 異尾雙鏈熒光探針構建 本研究使用的異尾雙鏈熒光探針由熒光探針鏈和淬滅探針鏈組成[5]，熒光探針鏈5'端標記熒光基團，3'端標記阻止延伸的基團，熒光探針鏈由5'端非同源序列區域和3'端模板互補區域組成；淬滅探針鏈序列和熒光探針鏈序列完全反向互補，在3'端標記熒光淬滅基團。

1.2.2 基本原理 當反應體系中不存在模板DNA時，熒光探針鏈與淬滅探針鏈堿基互補配對結合，熒光基團與淬滅基團之間形成非熒光復合物，二者通過氫鍵以質子偶聯的電子轉移相互作用，熒光基團由此被淬滅。檢測樣本時，首先通過不對稱聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增產生大量單鏈DNA片段；然后將反應體系升溫至95 ℃，熒光探針鏈與淬滅探針鏈受熱分離，成為單鏈游離狀態；隨后降溫至40 ℃，熒光探針鏈與單鏈DNA模板特異性雜交，熒光基團與淬滅基團脫離接觸發出熒光。見圖1。

圖1 異尾雙鏈熒光探針法點突變檢測原理示意圖

1.3 方法

采用Primer Premier軟件設計PCR引物和異尾雙鏈熒光探針，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并純化。熒光探針、淬滅探針序列及多重PCR分管見表1。PCR反應體系：總體積為25 μL，5×GoldStar PCR Master Mix（江蘇康為世紀生物科技股份有限公司）5 μL，熒光探針或淬滅探針各0.1 μL，引物各0.2 μL，模板DNA 2 μL，用無酶水補足反應體積。根據熒光探針或淬滅探針的濃度（10、20、50 nmol/L）和引物的濃度（50、200、1 000 mol/L）構建不同的反應體系。反應條件：40 ℃保溫8 min，采集各熒光通道信號值；95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，50個循環；95 ℃變性5 min，40 ℃保溫20 min，每分鐘檢測各通道熒光信號值。檢測儀器為ABI 7500熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

表1 引物探針序列和多重PCR的分管

1.4 數據分析

1.4.1 孔間校正 每份樣本分別進行3管反應，記錄最后1個循環各通道熒光強度（F）和對應通道空白對照的熒光強度（F0），FAM/VIC/NED/CY5通道熒光強度和ROX通道熒光強度的商即為校正的樣本熒光強度（Fn）和空白對照的熒光強度（Fn0）。

1.4.2 熒光背景校正 以Fn0作為熒光背景，計算樣本熒光強度凈增量（ΔFn），計算公式為：ΔFn=Fn-Fn0。

1.4.3 熒光強度凈增量計算 計算待測樣本與對應通道野生型的熒光強度凈增量差值ΔΔFn，ΔΔFn=ΔFn樣本-ΔFn野生型。

1.4.4 閾值設置 檢測突變位點陽性臨床樣本，計算突變位點目標熒光凈增量差值ΔΔFn的均值ΔΔF，熒光閾值=ΔFn野生型+ΔΔF/2。

1.4.5 結果判定 實際檢測時將待測樣本與野生型樣本、空白對照同時檢測，待測樣本扣除野生型樣本得到ΔΔFn值，比較ΔΔFn值與熒光閾值判定點突變。

1.5 方法性能評價

1.5.1 準確性和特異性 將全套地貧核酸檢測國家參考品按說明書要求進行檢測。（1）準確性：本方法檢測范圍內的國家陽性參考品的結果應為相應基因型別；（2）特異性：國家陰性參考品和本方法檢測范圍外的國家陽性參考品的結果應為未檢出突變。

1.5.2 靈敏度 選擇常見的非缺失α-地貧突變型與β-地貧基因點突變型（Hb CS、CD41/42、IVS-II-654）參考品梯度稀釋至1.0、2.5、5.0、10.0 ng/μL，每份樣本檢測3次。

1.5.3 方法比較 將異尾雙鏈熒光探針法與PCR-反向點雜交法[試劑盒購自亞能生物技術（深圳）有限公司]同時檢測200份已知地貧基因型的臨床樣本，評估臨床標本檢測的準確性與特異性。2種方法結果不一致的樣本采用測序法確認。

2 結果

2.1 異尾雙鏈熒光探針法的建立與評估

按照設計方案（圖2），建立多重不對稱PCR及異尾雙鏈熒光探針雜交的反應體系和反應條件并進行評估、優化。檢測過程：首先通過多重不對稱PCR產生大量單鏈DNA片段；PCR反應結束后，熒光標記探針與單鏈DNA雜交，通過熒光信號值判定點突變的有無及具體類型。

圖2 地貧基因點突變檢測方案

2.1.1 PCR反應體系 使用基因組DNA樣本評估不對稱PCR擴增的特異性。使用人工合成單鏈DNA與異尾雙鏈熒光探針雜交，獲得可區分野生型與突變型模板的探針對。使用優化的不對稱PCR與探針雜交體系檢測模擬雜合樣本，確定反應體系與反應條件。PCR反應產物見圖3。

圖3 多重不對稱PCR特異性擴增目標區域單鏈DNA片段

2.1.2 熒光信號增量閾值確定 采用建立的異尾雙鏈熒光探針雜交法檢測臨床樣本，并對檢測結果進行分析和計算，確定判定突變的熒光信號增量閾值。見表2、圖4。

表2 3管反應檢測結果的解釋（ΔΔFn值）

圖4 3管反應檢測11種突變樣本結果

2.2 異尾雙鏈熒光探針法的檢測性能評價

2.2.1 準確性和特異性 按地貧核酸檢測國家參考品說明書要求，采用異尾雙鏈熒光探針雜交法檢測全套參考品。結果顯示，對于檢測范圍內的11種點突變樣本，異尾雙鏈熒光探針雜交法檢測結果與國家參考品說明書標示的突變類型的符合率為100%；對檢測范圍外的其他點突變或缺失突變樣本，異尾雙鏈熒光探針雜交法均未檢出。見表3。

表3 國家參考品檢測結果

2.2.2 靈敏度 采用異尾雙鏈熒光探針雜交法檢測1.0、2.5、5.0、10.0 ng/μL的α-地貧Hb CS點突變參考品和β-地貧CD41/42、IVS-II-654點突變參考品，結果均與國家參考品說明書中提供的突變類型一致。

2.2.3 臨床樣本檢測 同時采用異尾雙鏈熒光探針雜交法和PCR-反向點雜交法檢測200份臨床樣本。結果顯示，異尾雙鏈熒光探針雜交法與PCR-反向點雜交法的符合率為100%。見表4。

表4 2種方法檢測臨床樣本的結果比較

3 討論

正常人每條16號染色體上有2個α-珠蛋白基因，即α1（HBA1）基因和α2（HBA2）基因，二者表達同一種產物α-珠蛋白鏈。正常情況下，α2基因較α1基因的功能更強，前者表達量為后者的2倍。α2與α1為高度同源基因，二者序列相似性約為94%，GC含量約為75%，編碼區序列完全一致，僅5'端非翻譯區與內含子區域存在序列差異[1]。α-地貧基因簇同時存在α2、α1的同源基因HBZ和假基因HBZP1、HBM、HBQ1。中國人群常見的3種非缺失型α-地貧突變Hb WS、Hb QS和Hb CS均發生在HBA2基因編碼區[2]。與α-地貧類似，β-地貧基因HBB與HBD堿基序列高度相似，β-地貧基因簇上還存在HBG1、HBG2、HBE、HBBP1等同源基因或假基因。中國人群常見的β-地貧點突變均發生在HBB基因1號外顯子和2號外顯子區，該區域GC含量約為50%；其中，IVS-Ⅱ-654突變位于2號內含子深處，該區域GC含量約為15%[2，6]。

目前，用于非缺失型α-地貧與β-地貧點突變檢測試劑盒主要采用PCR-反向點雜交法、多重熒光熔解曲線法[7]。PCR-反向點雜交法是一種較成熟的檢測技術，臨床應用較廣泛，檢測過程包括PCR擴增與膜雜交顯色兩部分，可檢測常見點突變與缺失突變，其檢測過程耗時較長，包含大量繁瑣的手工操作，效率較低。此外，PCR產物開管檢測存在污染風險。多重熒光熔解曲線法近年來逐漸被用于地貧突變檢測，該方法首先進行PCR擴增獲得目標片段，然后使用雙端標記熒光探針或雙雜交熒光探針與目標片段雜交，最后通過熔解曲線分析獲得熔點信息[8-10]。熒光熔解曲線法由于探針設計的特點，對于探針覆蓋范圍內相鄰的突變位點，其熔點差異較小甚至存在熔點交叉，檢測結果只能判定含有2種突變中的一種，需要通過測序法才能鑒定出具體的突變類型。因此，開發一種能夠快速、簡單、準確檢測非缺失型α-地貧與β-地貧點突變的方法具有重要的臨床意義。

為解決上述難題，本研究采用多重不對稱PCR結合異尾雙鏈熒光探針進行檢測。具體設計如下：（1）所有PCR引物均設計為具有較高的Tm值（Tm＞70 ℃），PCR擴增時采用較高的退火和延伸溫度，一方面使變性的雙鏈DNA維持單鏈狀態以便與引物結合和延伸；另一方面，較高的退火溫度使引物與目標區域特異性雜交，避免相似序列干擾。（2）利用單管反應檢測多種點突變時，應盡可能提高探針與目標模板的雜交效率，盡可能降低探針與背景模板的雜交效率，從而獲得較高的信噪比。有研究發現，在微陣列芯片的探針雜交反應中，單鏈DNA相比雙鏈DNA有著更高的雜交效率，可獲得更高的檢測靈敏度[11-12]。本研究采用多重不對稱PCR方式，3對引物分別擴增α2基因片段、β基因突變熱點區域以及IVS-Ⅱ-654區域，獲得目標區域單鏈DNA片段。相對于熒光熔解曲線法，本研究使用的PCR反應體系復雜度低，僅使用2條引物即可獲得目標區域單鏈DNA片段，無需使用額外的嵌套引物或巢式引物[13]，僅需優化每條PCR引物用量即可獲得大量單鏈DNA片段，為異尾雙鏈熒光探針雜交反應提供充足的單鏈DNA模板，并產生更高的熒光信號，直接通過熒光信號值即可進行結果判定，無需采用復雜的熔解曲線分析和熔點判斷[14]。（3）異尾雙鏈熒光探針的探針鏈被設計為較低的Tm值（60 ℃），淬滅探針鏈被設計為極低的Tm值（40 ℃），PCR過程中熒光探針鏈、淬滅探針鏈受熱解鏈，由于探針Tm值顯著低于PCR的退火、延伸溫度，熒光探針鏈、淬滅探針鏈均處于游離狀態，避免了探針與DNA雜交導致的引物延伸受阻，以及Taq酶切割探針引起的PCR反應前后探針總量變化。（4）由于異尾雙鏈熒光探針法通過熒光探針-模板特異性雜交與鏈置換反應進行檢測，探針設計具有極大的靈活性；本研究針對每個待檢測突變位點分別設計1對特異性的異尾雙鏈熒光探針；同時，參考中國人群非缺失α-地貧與β-地貧點突變復合發生的位點與頻率信息，將常見復合雜合位點設置在不同反應管中[3]；通過熒光信號或熒光信號組合即可準確判定突變類型，不受突變位點之間位置關系限制，也無需測序鑒定。與熒光熔解曲線法類似，本研究采用的異尾雙鏈熒光探針法為閉管反應模式，只需加入DNA即可進行PCR反應與熒光檢測，整個檢測過程均由PCR儀在3 h內完成，反應結束后無需進行開蓋處理，不存在PCR產物污染風險。

地貧核酸檢測國家參考品作為國家體外診斷試劑標準物質，由中國人群常見的α-地貧缺失與非缺失突變、β-地貧缺失與非缺失型突變組成，用于地貧基因檢測試劑盒的性能評價。本研究按國家參考品說明書要求，采用異尾雙鏈熒光探針法進行檢測，結果表明：（1）點突變型樣本，包括單堿基替換、單堿基插入與多堿基插入等變異類型，均被準確檢出，不存在假陰性或非特異性結果；（2）正常樣本、缺失樣本檢測結果均為陰性，不存在假陽性結果；（3）異尾雙鏈熒光探針法檢測限為1 ng/μL，低于國家參考品說明書要求的10 ng/μL。因此，異尾雙鏈熒光探針法的性能指標符合國家參考品要求，檢測結果準確可靠。

同時，本研究檢測了200例臨床樣本，變異類型包括3種非缺失型α-地貧、8種β-地貧點突變。驗證結果表明，異尾雙鏈熒光探針法對97例陽性樣本、103例陰性樣本的檢測結果與PCR-反向點雜交法一致。

綜上所述，本研究利用多重不對稱PCR與異尾雙鏈熒光探針技術建立了一種通過3管反應檢測3種非缺失型α-地貧突變與8種β-地貧點突變的方法。經地貧核酸檢測國家標準品與地貧臨床標本驗證，其性能指標均滿足要求，能夠準確、快速、可靠地檢測11種地貧點突變，具有較高的臨床應用價值。