食品中微生物限量要求及檢測技術發展趨勢

熊義愛

（商洛市食品安全檢驗檢測中心，陜西商洛 726000）

我國近年來頒布和修改了許多產品國家標準，已基本覆蓋了人們日常生活中接觸的大多數食物。但目前國家標準未能涵蓋所有的食物，此類食品因無相應的國家標準可依，造成了對其微生物的日常檢驗與監督不足。

1 食品中微生物限量要求現狀

1.1 預包裝食品

國家對不同預包裝食品中的基礎微生物項目菌落總數、大腸菌群、霉菌和酵母數的限量規定不同，重要判斷依據為產品相應的國家標準。由于罐頭食物通常是真空包裝，對其重點檢驗項目規定為商業生產無菌[1]。預包裝食品致病菌的限量要求主要依據《食品安全國家標準 預包裝食品中致病菌限量》 （GB 29921—2021），該標準規定了乳制品、肉制品、水產類制品、即食蛋制品、糧食制品、即食蔬菜制品、巧克力類及可可制品、飲料、冰凍飲品、即食調味品和堅果與籽類等13類食品中的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌、致泄大腸埃希氏菌、克洛諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）和副溶血性弧菌6種致病菌的檢測方法和限量。食品安全國家標準的內容涉及范圍廣，對預包裝食品的微生物監測較全面，為地方監管部門對預包裝食品的監督管理工作提供了重要依據，并有效保證了此類食品的食用安全性[2]。

1.2 散裝食品

2022年以前，我國缺乏對散裝即食食品中基礎微生物及致病菌的限量標準，部分散裝即食食品中的基礎微生物及致病菌的限量指標會參考我國相關食品行業的生產規范和企業標準。但部分生產規范明確指出只應用于預包裝食品，或明確指出不宜用作現制現售食物，如現制作的蛋糕或包子。《食品安全國家標準 糕點、面包》（GB 7099—2015）也規定，該規范中的菌落總數和大腸菌群國家標準不宜用作現制或現售商品。大多數非預包裝即食食品都無可依據的產品規范，如米飯、腸粉、饅頭等。 GB 29921—2021中雖提出了對致病細菌的限量條款，但其僅應用于預包裝食品。2016年7月27日，廣東省衛生和計劃生育委員會出臺了《廣東省食品安全地方標準 非預包裝即食食品微生物限量》 （DBS 44/006—2016）地方規范，彌補了對散裝即食肉制品微生物限量規范的空缺，但在全國區域內通用的標準仍空缺，導致此類食品，特別是占比較大的餐飲業及現售行業的微生物監測與日常監督工作陷入了無章可循的局面[3]。

2 食品微生物檢驗技術的現狀

2.1 傳統檢測法

傳統檢測法是目前實驗室的主要檢測方法，在潔凈室內將待測物用0.85%生理鹽水稀釋，制成符合要求的樣品均液，涂布或注入相應選擇性的培養基上，在特定的溫度下需氧或厭氧培養24～48 h，有的甚至需要培養10 d，期間需配制試劑、環境監測、增菌、分離、純化、革蘭氏染色、鏡檢和生化鑒定等一系列實驗，實驗結果準確性較高，不足之處是耗時費力。

2.2 微生物測試片法

微生物測試片通常由介質、冷水或凝膠、顯影劑等組成。顯影劑通常由細胞代謝物和顏色基因組成，在細胞生長過程中利用代謝蛋白與光致變色底物相互作用，彩色顯影介質的原理和結構基本相同[4]。該方法具有操作簡單、誤差較小和效率高等優點。測試過程中無需配備試劑，大大提高了檢測效率，有效減少了測試誤差，可在24～48 h完成測試。以比色法為基礎的分析方法比一般方法更適合計數，更適合用于實驗室快速檢測。目前，市場上的主要快檢品牌有3M（美國）、美正生物（中國）、路橋（中國）、DNP（日本）、環開（中國）和建一（中國）。

2.3 全自動快速培養方法

隨著對智能化和質量要求的提高，微生物檢測方法正逐步將傳統的手工操作與高度智能化的生物監測系統融合，涉及儀器設備、試劑等。自動微生物檢測裝置主要包括快速測定和鑒定裝置，但其也使用了傳統的培養和鑒定原理。例如，諾金soleris系列由實時光伏發電測試儀和大數據組成分析軟件及相應的檢測試劑盒組成[5]。細菌的代謝過程會產生光，從而改變培養基的生化特性和試劑S的顏色，Oleris光學系統實時監測上述化學變化引起的光度變化，細菌濃度越高，檢測時間越快[6]。

2.4 免疫分析

免疫分析的基本原理是利用特異性反應抗原或抗體快速檢測靶細胞。目前主要有兩種產品，即膠體檢測卡和酶聯免疫吸附測定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）試劑盒。這兩種技術都比較成熟。目前，國內大多數企業生產的檢測產品可以檢測到農藥、獸藥殘留和非法添加劑，但細菌性產品相對較少。在國內外市場上主要有艾默氏、美正生物和默克等品牌，主要產品有沙門氏菌、大腸桿菌O157和李斯特菌等檢測項目[7]。目前，酶聯免疫吸附測定技術已進入成熟階段，若能從細菌中獲得特異性抗原抗體，也可通過ELISA試劑盒檢測，還可以開發該盒的快速測試功能。目前，三明治模式仍是應用最廣泛的微生物檢測方法。該檢測方法具有靈敏度高、特異性強的優點。目前，國內市場上采用該技術的品牌有百發、美利爾和美正生物等。

2.5 三磷酸腺苷（ Adenosine-triphosphate， ATP）熒光檢測方法

ATP檢測最早于20世紀80年代在英國開發，后來發展到歐盟、美洲和日本。自20世紀90年代以來，ATP檢測法已廣泛應用于食品加工行業，包括食品加工、超市和餐館，檢測細菌和食物殘渣中的三磷酸腺苷。ATP廣泛存在于各種生物體中。通過檢測ATP，人們可以間接地確認生物體的存在。根據螢火蟲發光原理，通過測定三磷酸腺苷（ATP）、熒光素和熒光素酶（Luciferase）系統，可以快速判斷人體健康狀況。ATP熒光檢測方法可對食品飲料加工、餐飲、綜合醫院和水產養殖等進行環境監測，對醫療系統和食品衛生監督進行實時抽樣檢查。但由于ATP可以在任何生物中形成，所以ATP方法也可以測量清潔度，通過實驗測試估算細菌濃度，而不是直接判斷細菌的存活和濃度。

2.6 聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR)

（1）熒光定量PCR。熒光定量PCR技術，即在PCR擴增過程中，利用熒光信息實時監控PCR的發展。由于PCR擴增模塊的CT值與模塊的初始拷貝數之間存在線性關系，可作為定性依據。目前，國內PCR儀器的主要品牌包括Semefeld、Roche、Bole、天龍、雅瑞和紅石等。食品檢測領域使用的試劑盒或檢測系統的主要品牌包括杜邦Bax、默克、Semefeld和美正生物等品牌。試劑盒主要包括沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、克羅諾桿菌、大腸桿菌O157、單核細胞增生李斯特菌和諾沃克病毒等核酸檢測試 劑盒。

（2）等溫PCR技術。等溫PCR技術是近年來發展的新技術。通過采用PCR擴增儀對靶細胞進行擴增，采用瓊脂糖凝膠電泳對產物進行檢測，這一技術對溫度變化的反應靈敏度較高，操作更簡單。該技術更適用于現場快速測量。以一種DS分子控制器為例，該控制器采用熱放大環狀DNA和生物熒光處理技術，利用電子捕獲生物放大反應過程中形成的ATP發射的生物熒光，對DNA生物放大產物進行智能檢測，并以電子圖像和光學檢測點的形式顯示檢測結果。由于該方法通常對目標基因的檢測限較低，因此對實驗室人員的空間布局、檢測設施和操作條件提出了更嚴格的要求，實驗室需嚴格進行分子生物學分型試驗，以減少對環境污染檢測結果的影響。質譜是一種新的細菌鑒定方法，能快速鑒定現有的和未知的細菌，其基本原理是質譜儀的分子源通過電離效應使被測細菌具有更高的電子能力，在吸收電能后，目標細菌被激活，形成強大的電離效率，將載氣引入質譜儀，在電流的影響下加速導航[8]。由于不同的分子具有不同的質荷比，探測器上捕獲的帶電粒子產生的信號信息也不同，可通過與標準生物知識圖譜和質譜庫中的其他數據信號進行比較完成細菌的識別。

3 微生物檢測技術的發展趨勢

（1）廣譜快速富集培養的發展是未來的技術重點。大多數食品中的主要致病菌含量較低，很難檢測到食品中的少量致病菌。目前，檢測到的食源性病原體一般需要完成預濃縮步驟，每種病原體都有相應的生長習性和營養條件。因此，所有病原體都必須使用不同的富集介質，這對實際檢測的影響較大。因此，開發一種廣譜快速富集介質將是未來技術的重要發展方向。

（2）過程系統越來越受到重視，方法系統需從企業的實際應用情況進行充分的考慮。基于全球管理理念和從現場到風險分析形成的全過程管理體系規范，我國食品安全管理模式正逐步從成品檢驗向過程管理轉變，我國的標準化管理體系正在向強調基本標準和工藝規范[食品制造標準和危害分析的關鍵控制點（Hazard Analysis Critical Control Point，HACCP）]轉變。在過程控制的應用中，公司可建立適當的測試體系，采用過程控制的應用環節，通過使用快速測試方法建立適當的測試系統和開發快速測試方法。在食品微生物檢驗的過程中，檢驗人員需具備良好的分析判斷能力。在選擇微生物檢測技術時，企業需考慮可操作性、實驗室條件是否滿足精度以及成本等 因素。