對高效液相色譜法檢測技術的相關思考

馬 倩，胡自釗

（安康市質量技術檢驗檢測中心，陜西安康 725000）

高效液相色譜儀是一種高壓、高速、高效和高靈敏度的檢測儀器，尤其適合高沸點、熱穩定性差、相對分子質量大的有機物的定量和定性分析，在醫藥、環保、生命科學和食品安全檢測中被廣泛運用[1-3]。但在實際操作中，受目標檢測物含量低和樣品成分復雜的影響，會出現漏檢、錯檢、檢測時間長等現象。本文通過剖析高效液相色譜法檢測經常出現的問題，提出檢測分析的技術要點和控制措施，并對有問題的檢測結果進行綜合分析，以提高高效液相色譜檢測技術水平，滿足食品安全監管需要。

1 高效液相色譜法檢測過程中存在的問題

液相色譜檢測是以色譜峰的保留時間來進行定性分析，同一物質在同一色譜條件下應有相同的保留時間。但在實際食品添加劑檢測中經常會遇到復雜基質樣品，由于雜質成分與待測化合物性質相似或接近，就可能在色譜行為上表現一致，即使完全按照檢測標準操作，也有各種因素干擾結果的準確性，對于這些峰，僅靠保留時間定性，容易出現漏檢、錯檢、數據不準確和檢測時間長等問題。①漏檢是不能檢出該檢的組分，特別是低含量和復雜的組分，如黃曲霉毒素，毒性大、含量低，容易漏檢。②錯檢是對檢測結果的誤判，得出錯誤結論，俗稱“假陽性”。③數據不準確是檢測數據遠遠偏離真值，甚至忽高忽低，不能真實反映出樣品內組分情況。④檢測時間長是在檢測樣品多、指標多的情況下，從樣品進入預處理到出具檢測報告的時間長，甚至超過法定時限。因此，快速、準確地應用色譜分析來定性、定量目標物是檢測機構獲取準確、可靠的分析數據的關鍵。

2 高效液相色譜法檢測技術的質量控制

2.1 樣品前處理

前處理包括取樣、制樣、提取和凈化。正確的樣品前處理是保障檢測數據科學、準確的第一步。不正確、不規范的預處理可能導致譜圖產生雜峰、詭峰，影響目標峰的分析。嚴格控制預處理過程，盡力減少雜峰，突出目標物，避免在目標物出峰位置有干擾峰，造成假陽性的錯誤檢測結論[4-5]。

取樣要有代表性，嚴格按照規程進行混勻、縮分。①根據樣品狀態來制樣。固體要將其粉碎后再混勻；液體樣品制備前要搖勻；結晶樣品溶解后攪拌均勻，如有結晶析出的蜂蜜樣品，需將樣品的瓶蓋旋緊后置于水浴（溫度不超過60 ℃）中溫熱，待蜂蜜樣品全部溶化后攪勻、冷卻，再稱取樣品，從而保證樣品性質的一致性。②根據檢測項目的不同來制樣，如堅果炒貨食品，檢測污染物時需去殼處理，檢測添加劑時則需帶殼處理。

2.2 選擇合適的檢測方法

樣品的特性千差萬別，選擇準確的檢測方法是保障結果準確的必要手段，這就需要結合產品特性，根據標準要求選擇合規、合理的檢測方法。此外，應及時關注最新出臺的標準，若有變更，則需按照變更后的檢測標準進行環境、人員、設備和方法的驗證，確認具備實驗能力后，再按照變更的檢測方法進行檢測。

2.3 對儀器、試劑進行有效控制

2.3.1 對儀器的控制

為了保證儀器設備的日常使用和維護，檢驗室應指定儀器的管理人員，并明確職責。儀器的操作者必須通過培訓、考核后上崗，熟知儀器的工作性能、操作規程和安全指標。檢測儀器必須進行計量檢定，檢定合格后，方能進行檢測工作。通常要求在兩次檢定周期內至少開展1次期間核查，針對使用頻率較高的儀器，儀器使用人員應增加核查頻次，監測儀器的準確性和穩定性，把控正常損耗對儀器檢測結果的影響。此外，做好儀器的日常維護，完成相關記錄。

2.3.2 對試劑的控制

實驗室要有試劑管理規程，并按要求分類儲存，如避光、冷藏、有毒有害和易燃易爆等要有相應的儲存地點，并明示標簽。對于在使用或保管中的標準品需進行期間核查，通過質量控制保證標準品量值的準確可靠以及可溯源性[6]。

2.4 優化檢測環境

檢測環境條件對液相色譜檢測的準確性有重要影響，如環境溫度的不穩定會影響流動相的黏度，導致保留時間發生變化，影響檢測結果的重現性[7-8]。因此，做好日常監測和記錄，保證檢測環境符合檢測需求。同時，保持檢測環境的整潔，避免樣品間的交叉污染，有助于提高檢測效率。

2.5 提高檢測人員的操作水平

檢測員在檢測過程中應嚴格按照法律法規及標準規定，整個實驗過程都要保持科學嚴謹的工作態度，做到過程有記錄、結果可追溯。檢測機構應制定人員培訓計劃，持續有效的培訓有助于提升檢測人員的檢測水平。此外，實驗室應多組織檢測員參加外部的能力驗證和內部的質量控制考核，通過盲樣考核、比對實驗、加標回收和留樣復測等手段確保檢測員具備相應的檢測能力。

2.6 檢測儀器的維護與保養

科學的維護和保養可延長高效液相色譜儀的使用壽命、提高其運行效率。①嚴格按照要求規范開關機，開機完畢后、開始檢測前要進行全面檢查，保證設備處于良好狀態，不會對檢測產生不良影響。關機時切忌亂丟亂放，以免在下次使用時出現誤差，影響檢測結果。②注意維護實驗室環境，不能僅在工作時保證適宜的溫度和濕度，即使不工作時也要關注實驗室的溫度和濕度變化，以免造成設備故障或檢測數據不穩定。

3 可疑結果的綜合分析

高效液相色譜檢測結果往往會出現數值不準確、錯檢（假陽性）等情況，嚴格、規范地進行預處理是保證檢測結果準確的基礎。遇到可疑樣品時，應考慮制樣是否完備，標準是否正確執行，前處理過程是否準確，判定是否合理。排除這些因素后，進行可疑樣品復測，可采取以下手段進一步確認。

3.1 調整色譜條件

有的樣品比較復雜，會出現雜質峰，干擾結果判定，可通過調整流動相比例，消除雜質峰的影響，準確地進行定性分析。例如，在檢測肉制品中的防腐劑時，按照《食品安全國家標準 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》（GB 5009.28—2016）的要求，流動相為甲醇+乙酸銨，比例為5∶95，曾出現雜質峰影響苯甲酸的定性，將流動相甲醇+乙酸銨的比例調整為10∶90，雜質峰偏離苯甲酸出峰位置，有效避免了苯甲酸的錯檢。

3.2 加標實驗

在樣品前處理時添加標準品，對比保留時間、色譜峰、色譜峰面積的變化，對可疑檢測數據進行有效分辨。例如，在豆干樣品初測時檢出苯甲酸，根據《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》 （GB 2760—2014），豆干中不允許添加苯甲酸，因此需進行樣品復測。通過重新制備樣，加標復測后，苯甲酸標液峰和干擾峰分離，判定初測為假陽性。

3.3 使用二極管陣列檢測器檢測

通過保留時間和光譜信息圖進行綜合定性。當保留時間附近有可疑色譜峰出現時，比較標準溶液光譜圖與樣品處理液光譜圖的重合性，能夠進一步確證可疑色譜峰是否是目標待測物。例如，按照《食品安全國家標準 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》（GB 5009.28—2016）中的第一法——液相色譜法，采用二極管陣列檢測器對樣品中的苯甲酸進行測定，分別采集色譜圖和光譜圖，將樣品處理液與標準溶液色譜圖進行比較，以保留時間定性，若有檢出，則結合樣品與標準溶液光譜圖，從峰起點、峰頂點和峰落點再次確認。若樣品光譜圖與標準溶液的光譜圖完全不重合，可確證樣品的檢出結果為假陽性；若光譜圖完全重合，可確證樣品為陽性檢出。因此，結合保留時間和光譜圖進行綜合分析判定，可有效保證樣品檢測結果的準確性和可靠性。

3.4 液質聯用

由于受價格和耗材的限制，高效液相色譜-串聯質譜設備沒有得到廣泛應用，但它的優勢非常突出。它既能利用高效液相色譜對復雜化合物的分離能力，又綜合了高分辨率質譜對化合物的準確定性和定量，能夠同時測定多種化合物，且分析結果的靈敏性和準確性都能得到保障。童蘭艷等[9]采用高效液相色譜-質譜法同時測定食品中的9種甜味劑（甜蜜素、安賽蜜、糖精鈉、阿斯巴甜、阿力甜、三氯蔗糖、甜菊糖苷、愛德萬甜和紐甜），與國家標準檢測方法相比，分離效果好、靈敏度高，明顯提高了檢測效率。

4 結語

食品檢測面臨著新要求、新挑戰、新形勢，高效液相色譜技術憑借其準確性高、靈敏度好、分辨率高的優勢被廣泛應用于農獸藥殘留、食品添加劑、非法添加物、霉菌毒素、氨基酸和糖類檢測中，但因其操作要求高，未能廣泛普及，如很多市、縣檢測機構的高效液相色譜儀被閑置，沒能發揮出其應有的作用。

隨著科學技術水平的提高，不管是國家檢測機構還是第三方檢測機構，都在不斷完善儀器檢測管理制度。在實際操作中正確運用高效液相色譜法的技術要點，使儀器的功能和特點最大限度地被發揮和利用，才能提高高效液相色譜技術的使用率和準確率，保證檢測結果的準確性，更好地監管食品安全，真正做到讓老百姓吃得放心。