溫和灸足三里穴對自然衰老大鼠的腎臟保護作用及腎組織纖連蛋白、轉化生長因子-β1表達的影響

趙舒羽 劉文博 吳煥淦, 崔云華 張紓研 殷之光 戚 莉 劉世敏 林亞瑩 趙 琛 黃 艷,

(1 上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院，上海，200437；2 上海市針灸經絡研究所，上海，200030；3 上海中醫藥大學，上海，201203)

隨著年齡增長，人體器官的結構和功能都會發生相應的改變，器官衰老是各種老年疾病發生發展的生物學基礎，腎臟是衰老相關組織損傷的典型靶器官[1]。研究發現，在沒有高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化等衰老相關疾病的衰老人群中，腎臟也會發生多種結構及功能變化，可以認為這些變化是單純衰老所引起的腎臟改變[2]。

臨床研究表明，艾灸具有良好的延緩衰老作用。足三里穴是重要的保健要穴，已有實驗研究證實，艾灸足三里穴可增加超氧化物歧化酶等酶類抗氧化劑的含量，降低丙二醛等代謝產物的含量，具有良好的抗衰老作用[3-5]。課題組前期臨床研究發現，艾灸足三里、腎俞、關元等穴可改善老年人衰老相關癥狀[6-7]。本研究基于自然衰老大鼠模型，率先對衰老典型器官-腎組織進行靶向研究，以經典的小鼠衰老相關β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)作為腎臟衰老的生物學指標，通過觀察溫和灸足三里穴對自然衰老大鼠腎組織結構與功能的影響，并進一步觀察大鼠腎組織纖連蛋白(Fibronectin，FN)表達及轉化生長因子-β1(Transforming Growth Factor-beta l，TGF-β1)基因轉錄情況，研究溫和灸足三里穴對腎臟衰老的保護效應及機制。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性清潔級SD大鼠(56周齡、36周齡)，采購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[動物許可證號：SCXK(滬)2012-0002]，本研究得到上海中醫藥大學實驗動物福利與倫理委員會的批準，并在此批準下進行(倫理審批號：PZSHUTCM190524004)。動物實驗觀察室明暗各12 h，室內溫度為20～22 ℃，相對濕度為50%～70%，自由攝食與飲水。實驗動物適應性飼養1周。未發現不良反應，飲食和飲水均正常的動物方可用于實驗。實驗過程中對實驗動物的操作均符合動物福利的基本原則、3R原則等相關要求。

1.2 試劑與儀器 戊巴比妥鈉(Sigma公司，美國，貨號：P3761)；無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司，貨號：10009218)；多聚甲醛(國藥集團化學試劑有限公司，貨號：80096618)；二甲苯(國藥集團化學試劑有限公司，貨號：10023418)；中性樹膠(國藥集團化學試劑有限公司，貨號：10004160)；十二水合磷酸氫二鈉(國藥集團化學試劑有限公司，貨號：200040618)；磷酸二氫鈉(國藥集團化學試劑有限公司，貨號：200407008)；氯化鈉(國藥集團化學試劑有限公司，貨號：10019308)；鹽酸(國藥集團化學試劑有限公司，貨號：80070560)；細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒(碧云天公司，貨號：C0602)；無毒環保蘇木素-伊紅染液(南京建成科技有限公司，貨號：D006)；Masson染色試劑盒(博士德生物公司，貨號：GP1032)；大鼠Albumin定量ELISA試劑盒(司鼎生物科技有限公司，貨號：SDR005196T)；即用型SABC三步法試劑盒(博士德生物公司，貨號：SA1054)；抗纖連蛋白抗體(Anti-Fibronectin antibody)(上海艾博抗有限公司，貨號：ab23751)特制細艾條(南陽漢醫艾絨廠，直徑0.5 cm，長度12 cm)；光學顯微鏡及分析軟件(OLYMPUS公司，日本，BX53)；臺式高速離心機(Eppendorf公司，德國，5810R)。

1.3 分組與模型制備 56周齡SD大鼠常規喂養至80周齡，建立自然衰老大鼠模型。56周齡大鼠采用隨機數字表法分為自然衰老組、艾灸足三里組，每組10只。另購36周齡對照組大鼠10只。自然衰老組大鼠飼養至80周齡，單純抓取，不進行治療。艾灸足三里組大鼠14月齡開始進行溫和灸干預，穴位定位方法參考《實驗針灸學》(余曙光等主編，上海科學技術出版社，2014年出版)中常用動物穴位定位及相關文獻，采用直徑0.5 cm特制細艾條，溫和灸單側“足三里”穴，依據大鼠皮膚受熱程度調整高度，距離穴位皮膚2～4 cm，1次/d，20 min/次，左右兩側穴位交替進行，共干預6個月。

1.4 標本采集與處理 全部干預結束后，大鼠禁食24 h(不禁水)，放入大鼠代謝籠，編號收集尿液，離心(400×g，5 min)取得上清液，待檢。2%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉(0.2 mL/100 g)，剖開大鼠腹腔，干棉球鈍性分離腹膜及腸道組織，腹主動脈取血，離心(1 200×g，10 min)取上清，-80 ℃保存；于冰浴環境取大鼠雙側腎組織，將兩側腎臟分別十字剖開，分為8等份，左側迅速放入凍存管，-80 ℃保存；右側置于4%多聚甲醛，待測。

1.5 觀察指標

1.5.1 一般狀況觀察 大鼠的精神狀態、皮毛狀況、活動情況、體質量變化。

1.5.2 SA-β-gal表達檢測 腎組織冰凍切片中加入適當體積的SA-β-gal染色固定液，以充分蓋住組織為宜，室溫固定15 min；用1×磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline,PBS)浸泡洗滌腎組織3次，每次5 min；吸除PBS，組織切片上加入適當量的染色工作液；37 ℃孵育過夜；封片，4 ℃保存，光鏡下觀察并拍照。應用Image-pro-pius圖像分析系統進行圖像分析。每張切片隨機選取3個視野檢測積分光密度(Intergal Optical Density，IOD)取均值進行統計學分析。

1.5.3 組織病理學觀察

1.5.3.1 蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin，HE)染色 采用HE染色法對大鼠腎組織進行病理學觀察。石蠟切片脫蠟至水；浸于蘇木精缸中90 s；流水沖洗10 min；浸于1%鹽酸乙醇中分化3 s；流水沖洗5 min；浸于伊紅缸中2 min，蒸餾水中泡去多余染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察并拍照。

1.5.3.2 Masson染色 采用Masson染色法對大鼠腎組織進行病理學觀察。石蠟切片脫蠟至水；40 ℃溫熱水漂洗玻片2次，60 s/次，蒸餾水濕潤玻片30 s；R1核染液染色30 s，倒掉，沖洗液沖洗30 s；R2漿染液染色30 s，倒掉，沖洗液沖洗30 s；R3分色液分色8 min，棄去分色液；R4復染液復染5 min，倒掉，無水乙醇沖洗干凈；中性樹膠封片，光鏡下觀察并拍照。

1.5.4 24 h尿蛋白含量檢測 采用酶聯免疫吸附試驗法檢測各組大鼠24 h尿蛋白含量。將大鼠尿液與標本稀釋液作1∶100稀釋，配制標準品液，用雙蒸水1∶20稀釋；每孔各添加100 μL標準品液，充分混勻反應板，37 ℃靜置30 min，洗板；每孔加酶標抗體工作液100 μL，37 ℃靜置30 min，洗板；每孔加入底物工作液100 μL，置37 ℃暗處反應15 min；每孔加入100 μL終止液混勻，30 min內用酶標儀在450 nm處測吸光度。

1.5.5 腎組織FN表達檢測 采用免疫組織化學法檢測各組大鼠腎組織FN表達，烤片，依次置于二甲苯、梯度乙醇、0.01 mol/LPBS、3%過氧化氫溶液，正常山羊血清封閉液，室溫下孵育，添加一抗，4 ℃孵育過夜，加二抗，DAB顯色液，浸于蘇木精中復染、梯度乙醇、二甲苯、中性樹膠封片，待鏡下觀察。應用Image-pro-pius圖像分析系統進行圖像分析。每張切片隨機選取3個視野檢測IOD，取均值進行統計學分析。

1.5.6 腎組織TGF-β1mRNA表達檢測 腎組織研磨，裂解，檢測總RNA濃度和純度。引物設計參照Gene Bank數據庫中各目的基因的序列，引物由ABI公司的Primer Express Software v2.0設計，由華大基因公司合成。見表1。ABI ViiA 7 Real Time PCR System進行Real-time Quantitative PCR圖像和數據采集，基因表達倍數采用2-△△Ct進行數據分析。

表1 基因引物信息

2 結果

2.1 溫和灸對自然衰老大鼠一般情況的影響 36周齡對照組大鼠活動敏捷，毛色潔白，反應靈敏，飲食飲水無異常。自然衰老組大鼠隨著月齡的增長，活動欠靈活，毛發逐漸枯黃，精神不振，飲食飲水量減少。艾灸足三里組大鼠活動較靈活，毛發潤澤，色澤微黃，精力尚可，飲食飲水無異常，日常活動均有不同程度改善。

2.2 各組大鼠腎組織SA-β-gal染色比較 鏡下觀察，大鼠腎組織各層內均可看到SA-β-gal陽性表達。36周齡對照組腎組織中陽性表達染色較淡，出現陰性或弱陽性反應；自然衰老組腎組織中藍染面積較大，染色較深；艾灸足三里組腎組織中陽性表達較衰老組弱，藍染面積小，染色普遍偏淡。與36周齡對照組比較，自然衰老組、艾灸足三里組腎組織中SA-β-gal陽性表達顯著增加(P<0.05)；與自然衰老組比較，艾灸足三里組腎組織中SA-β-gal陽性表達顯著降低(P<0.05)。結果提示：80周齡自然衰老大鼠出現明顯的腎臟組織衰老，艾灸足三里穴可以改善腎臟衰老。見圖1、表2。

表2 各組大鼠腎組織中SA-β-gal陽性表達

圖1 各組大鼠腎組織SA-β-gal陽性表達(SA-β-gal染色，×200)

2.3 溫和灸對自然衰老腎組織病理學的影響

2.3.1 各組大鼠腎組織HE染色 36周齡對照組腎小球呈圓形或橢圓形，外周規整，分布密集，壁層上皮分布均勻，腎小球囊腔狹小，腎小管管腔規整；自然衰老組腎小球明顯膨大，可見積液，腎小球系膜細胞細胞密度增高，腎小球囊腔明顯擴大，腎間質出現少量炎細胞浸潤；艾灸足三里組腎小球輕度膨大，腎小球系膜細胞細胞密度輕度增高。見圖2。

圖2 大鼠腎臟組織病理學觀察(HE染色，×200)

2.3.2 各組大鼠腎組織Masson染色 膠原纖維染色呈藍色，36周齡對照組大鼠未見明顯膠原陽性染色；自然衰老組腎間質中可見大量藍色膠原纖維；艾灸足三里組僅見血管周圍少許膠原組織。見圖3。

圖3 大鼠腎臟組織Masson染色(Masson染色，×200)

腎組織HE染色結果提示：自然衰老大鼠腎組織結構損傷，腎間質出現纖維化。艾灸足三里穴組能夠減輕自然衰老大鼠腎組織病理學改變，改善腎纖維化狀態。

2.4 溫和灸對自然衰老大鼠24 h尿蛋白含量影響 與36周齡對照組比較，自然衰老組、艾灸足三里組24 h尿蛋白含量明顯增加(P<0.05)；與自然衰老組比較，艾灸足三里組24 h尿蛋白含量明顯降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠24 h尿蛋白含量比較[M(P25,P75)，mmol/L，n=10]

2.5 溫和灸對自然衰老大鼠腎組織FN表達的影響 FN陽性表達染色呈棕黃色，在腎組織各層內均可看到FN表達。36周齡對照組腎組織中FN陽性表達主要分布在腎小球系膜內，染色較淡，呈陰性或弱陽性反應；自然衰老組腎組織中FN表達較36周齡對照組增多，呈陽性反應；艾灸足三里組腎組織中FN蛋白陽性呈弱陽性反應，表達較衰老組明顯減弱。與36周齡對照組比較，自然衰老組、艾灸足三里組腎組織FN表達均顯著增加(P<0.01)；與自然衰老組比較，艾灸足三里組腎組織FN表達顯著降低(P<0.01)。見圖4，表4。

圖4 各組大鼠腎組織中FN表達(免疫組織化學染色，×200)

表4 各組大鼠腎組織中FN表達

2.6 溫和灸對自然衰老大鼠腎組織中TGF-β1mRNA水平的影響 與36周齡對照組比較，自然衰老組、艾灸足三里組腎組織中TGF-β1mRNA表達明顯增加(P<0.05)；與自然衰老組比較，艾灸足三里組腎組織中TGF-β1mRNA表達明顯降低(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠腎組織中TGF-β1 mRNA表達[M(P25,P75)，n=10]

3 討論

器官衰老是指個體生命進程中，因體內、體外因素引發的器官組成細胞的丟失和細胞外基質聚集，導致器官整體功能下降、對損傷因素易感性增強和應激反應能力的下降[8]。隨著年齡的增長，腎臟的宏觀和微觀結構均會相應地發生變化。在微觀結構水平上，腎臟的衰老主要表現在出現腎間質纖維化、腎小球硬化、基底膜增厚、腎小管萎縮和動脈硬化等病變[9]。本研究采用的自然衰老大鼠模型是抗衰老研究的理想動物模型，它能較精確且完整地反映機體衰老狀態，符合人類衰老的特點。SA-β-gal是衰老研究的經典指標，表達SA-β-gal被認為是衰老細胞的特異性的標志。基于此模型，我們以經典的SA-β-gal作為腎臟衰老的生物學指標，觀察36周齡(青年)大鼠和80周齡(老年)大鼠腎組織SA-β-gal的表達，鏡下發現，在大鼠腎組織各層內均可看到SA-β-gal表達，36周齡對照組大鼠腎組織中陽性表達染色較淡，呈陰性或弱陽性反應；自然衰老組大鼠腎組織中藍染面積較大，染色較深，提示80周齡組大鼠已經出現了明顯的腎臟衰老表型。HE染色顯示，36周齡對照組大鼠腎小球呈圓形或橢圓形，外周規整，分布密集，壁層上皮分布均勻，腎小球囊腔狹小，腎小管管腔規整；自然衰老組大鼠腎小球明顯膨大，可見積液，腎小球系膜細胞細胞密度增高，腎小球囊腔明顯擴大，腎間質出現少量炎癥細胞浸潤。Masson染色鏡下觀察結果顯示，36周齡對照組大鼠腎組織未見明顯膠原纖維增生改變；自然衰老組腎間質中可見大量藍色膠原纖維。2組大鼠腎組織病理染色及纖維化染色表現符合腎臟衰老的病理改變及既往研究[10-11]。隨著年齡增長，腎臟功能隨之改變，腎臟衰老與腎損傷之間存在線性關系。本實驗研究結果顯示，與36周齡對照組比較，自然衰老組大鼠24 h尿蛋白水平升高，提示衰老大鼠發生增齡性腎功能減退和腎纖維化病理學改變。

腎纖維化是腎臟衰老過程中的重要病理變化，是導致增齡性腎功能減退的主要原因[12-13]。FN是一種重要的細胞外基質蛋白，具有結合纖維蛋白原和膠原的能力，在正常情況下呈現低表達，在病理狀態下表達增多，其改變主要反映腎組織細胞外基質的變化。同時，FN是腎纖維化的效應因子，在纖維化的早期即可形成并廣泛沉積，是反映腎纖維化的直觀指標之一[14-15]。轉化生長因子-β(TGF-β)，屬于轉化生長因子超家族的多功能細胞因子，包括3個不同的哺乳動物同工型(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)。TGF-β1在腎臟的表達最多，活性最強。已證實，TGF-β1是一種強效的致纖維化因子[16]，也是腎小管上皮-間充質轉化的重要的誘導劑，在腎纖維化時表達增加，是目前抗纖維化治療的主要靶標。本研究中，我們采用免疫組織化學法、實時定量PCR法分別檢測腎組織中FN表達、TGF-β1mRNA表達，發現與青年對照組大鼠比較，自然衰老組大鼠的腎間質中可見大量藍色膠原纖維，腎組織中FN表達增加，TGF-β1基因轉錄增強，TGF-β1mRNA表達增加。有報道，無論是原癌基因、應激誘導衰老以及復制性衰老的人成纖維細胞中都發現TGF-β1分泌增加[17-18]，衰老大鼠腎組織中也發現TGF-β1升高[19]。我們推測衰老過程中FN、TGF-β1分泌增多是衰老相關腎纖維化及腎功能減退的潛在原因。

艾灸療法用于延緩衰老歷史悠久，古今醫家均證實了艾灸延緩衰老的有效性?！夺樉恼嫠琛吩唬骸叭镳B后天之氣，灸三里可使元氣不衰，故稱長壽之灸。”有研究對溫針灸關元、足三里穴延緩衰老的作用進行觀察，結果顯示，溫針灸提高老年人血液的超氧化物歧化酶含量，具有明確的抗衰老作用[20]。廖運新等[21]為120例老年患者施灸，發現老年患者免疫功能得到明顯加強，各衰老指標與灸前比較有顯著性差異。大鼠的動物實驗結果也支持了溫和灸干預衰老的有效性[22]。本研究發現，溫和灸足三里穴有效降低模型大鼠腎組織衰老標志物SA-β-gal的表達，改善腎臟衰老。我們進一步從腎組織結構和功能觀察艾灸對腎臟衰老的影響，HE染色和Masson染色結果提示，溫和灸足三里穴改善了自然衰老大鼠的腎小球結構，減輕腎組織炎癥，明顯抑制了腎間質纖維化。研究結果顯示，溫和灸足三里穴降低了衰老大鼠24 h尿蛋白含量，提示溫和灸足三里穴改善大鼠增齡性腎損傷。免疫組織化學結果顯示，溫和灸足三里穴有效降低了衰老大鼠腎組織FN表達。實時定量PCR結果顯示，溫和灸足三里穴有效降低了衰老大鼠腎組織TGF-β1mRNA表達，提示抑制FN表達、TGF-β1基因轉錄可能是溫和灸足三里穴發揮保護腎臟的作用機制之一。

中醫學理論認為衰老是人體各項功能整體性下降的過程，這一過程可以理解為虛證，臟腑虛損是機體增齡性變化中的核心部分，不僅是衰老的特征表現，也是衰老的重要原因。五臟虛損日久則因虛致實，產生痰、瘀等病理產物，以致虛實夾雜，加速機體衰老。盡管各種老年慢性疾病的表現各異，但均以其器官衰老及功能減退作為疾病發生的生物學基礎。因此，研究器官衰老及保護衰老器官功能是減少老年慢性疾病發生的前提條件。足三里穴是足陽明胃經之合穴，胃之下合穴，具有調理脾胃，補中益氣的作用。《景岳全書》云：“胃為水谷之海，得后天之氣也，人之始生，本乎精血之原，人之既生，由于水谷之養，非精血無以立形體之基，非水谷無以成形體之壯?！笨梢姲淖闳镅ㄊ茄泳徦ダ系闹匾侄沃?。

本實驗聚焦器官衰老角度探討艾灸延緩衰老的可能機制，發現溫和灸足三里穴能夠改善自然衰老大鼠腎結構和減輕腎損傷，抑制腎組織FN表達、TGF-β1基因轉錄，延緩腎臟衰老，實驗結果為艾灸延緩腎臟衰老的機制研究提供了初步證據。