轉基因玉米培育及其檢測技術應用研究

李 晶 尹祥佳 王雅琳

（蘭州職業技術學院，甘肅蘭州 730070）

玉米是全球及我國第一大糧食作物，也是草食畜牧業和飼料行業的重要作物，其作為雜種優勢研究和應用非常廣泛，對穩定我國糧食生產安全，調整農業種植結構，增加農民收入等都具有重要的貢獻。根據國家統計局數據顯示，我國2020 年玉米播種面積為 4126.4 萬hm2，玉米產量約2.6 億t。預計到2030 年，我國玉米生產的需求量將達到3.03 億t[1-2]。為保障玉米種植業的持續穩定發展，需要加大玉米新種質的選育，常規的玉米品種選育是通過選擇育種、雜交育種、回交選育、誘變育種、群體改良等育種方法的集成育種，但選育周期較長，材料自主創新難度較大，再加上玉米種子品種的市場化程度較高，為了獲取更多的效益，往往導致玉米種質遺傳基礎狹窄，市場上的品種同質化趨勢加大，都會對玉米的生產帶來一定的難度。隨著基因工程技術和分子生物學技術的發展，以轉基因技術為代表的生物技術在玉米品種選育過程中的應用作用日益凸顯，尤其是通過育種設計，將生物技術育種與常規育種技術的結合，成為了重要的玉米新品種選育途徑。

1 玉米轉基因技術

轉基因技術也稱之為基因工程技術，在農業領域的應用非常廣泛，包括玉米轉基因研發在內的糧食作物品種的選育和改良成為了重要的農業科技攻關方向。1983 年世界上首次報道了轉基因煙草的研發成功，帶動了我國轉基因作物育種。通過轉基因技術的應用加速玉米種質資源的創新，在玉米種質改良過程中發揮著重要的作用[3]。1986 年我國啟動了國家高技術研究發展規劃，也就是“863”計劃，將轉基因植物在內的生物技術研發作為重點支持研究領域，隨著研究的深入開展和積累，我國培育了自主知識產權的抗蟲轉基因棉花，并投入商業化生產。此外，國家重大基礎研究計劃（“973”計劃）也將轉基因育種列為重要的支持研究領域，特別是2008 年我國開始實施的轉基因生物新品種培育國家科技重大專項，有效實現了包括玉米在內的五大作物的轉基因育種和常規育種的深度結合，研發出了一批重要的新品種和新材料。由中國農業科學院生物技術研究所和北京奧瑞金公司聯合研發并于2009 年獲得了原農業部頒發的轉植酸酶基因玉米自交系的安全證書，成為了我國轉基因玉米研究的重要創始之作[4]，2015 年轉植酸酶基因玉米再次獲得安全證書。2019 年北京大北農生物技術有限公司的DBN9936 和杭州瑞豐生物科技有限公司的雙抗12-5 獲得安全證書。2020 年北京大北農生物技術有限公司研發的耐除草劑轉基因玉米獲得農業農村部科技教育司頒發的農業轉基因安全證書，有效期為5 年。2021 年中國農業大學國家玉米改良中心培育的抗蟲玉米ND207 獲得生物安全證書，杭州瑞豐研發的浙大瑞豐8 抗蟲和耐除草劑轉基因玉米、北京大北農生物技術有限公司研發的DBN3601T 雙價抗蟲和耐除草劑轉基因玉米獲得轉基因玉米安全證書。2022 年杭州瑞豐耐除草劑玉米和中國種子集團有限公司的3 個轉基因玉米獲得轉基因安全證書。轉基因玉米研發的常用轉基因技術有農桿菌介導法、基因槍法和花粉管通道法。

1.1 農桿菌介導法農桿菌是自然界存在的，農桿菌介導的玉米遺傳轉化方法是最常用，也是最有效的玉米轉化方法。在試驗操作層面是將待轉化的外源目的基因整合到經過改造的遺傳轉化的T-DNA 區，借助農桿菌侵染植物的細胞，實現外源基因與植物基因組的轉移與融合[5]，再利用植物組織培養再生體系，培育出轉化再生的植物植株，再進一步進行轉基因的檢測確定以及后代轉化的穩定性分子和植物生理學鑒定，得到穩定表達的轉基因植株。謝超等[6]采用農桿菌轉化方法將提高玉米籽粒類胡蘿卜素基因chyb基因和耐草甘膦bar基因轉入玉米品種7922 中，獲得品質改良和抗除草劑的玉米育種材料。王陽等[7]對抗蟲基因cry1Ab進行改造后獲得新的基因cryFLIa，用農桿菌轉化HiII 玉米幼胚，通過轉基因檢測抗性和轉化后代的抗病鑒定試驗得到了抗亞洲玉米螟的玉米材料。農桿菌介導玉米轉化方法主要的轉化受體為玉米幼胚誘導的愈傷組織、玉米幼胚、玉米黃化苗的莖尖，農桿菌的菌株主要有EHA105、C58 和LBA4404。

1.2 基因槍法基因槍法是一種物理的轉化方法，又稱為粒子槍法，是采用高速的金屬微粒表面的外源DNA 分子隨機整合到植物受體細胞中[8]。李志亮等[9]選用玉米自交系京501 誘導的愈傷組織，采用基因槍法轉化P5C5基因獲得轉基因材料，并進行了抗旱性鑒定，結果顯示P5C5基因能夠在干旱脅迫下通過基因的表達提高脯氨酸含量、降低丙二醛含量來提高轉基因玉米的抗旱性。韓平安等[10]用基因槍對玉米自交系A188 誘導的幼胚愈傷組織進行轉化cp4EPSPS基因，獲得抗草甘膦轉基因玉米材料。基因槍法轉化玉米的主要受體材料有幼胚、愈傷組織和莖端分生組織[11]。

1.3 花粉管通道法花粉管通道法最早應用在煙草的轉化當中，我國學者周光宇于20 世紀80 年代創立了花粉管通道轉化技術，主要是采集植物花粉進行處理，然后利用天然花粉管通道將外源DNA 目的基因攜帶進入胚囊實現外源基因的遺傳轉化[12]。韓猛等[13]選用玉米自交系京24，將BADH基因通過花粉管通道法進行轉化，并對T2轉基因植株進行了耐鹽性生理指標的鑒定，得到了耐鹽性自交系材料。陳麗娟等[14]選用玉米自交系京517、京501 和吉444，構建了bar基因為篩選標記基因和CspB為目的基因的雙價植物表達載體，通過花粉管通道法實現了轉化受體材料的耐旱性和耐除草劑等性狀改良。花粉管通道法因受到外界環境的影響較大，所以最好選擇晴天進行試驗，這樣可以減少花粉質量對轉化效率的負面影響。除此之外，外源DNA 片段的大小、濃度、純度，田間導入量和導入時間也是影響轉化效率的因素。近些年，采用超聲波輔助花粉介導的方法能夠有效提高轉化效率，不受實驗室植物組織培養的限制。

2 轉基因玉米培育

目前，轉基因玉米培育的目標性狀主要是在抗蟲轉基因玉米、耐除草劑轉基因玉米、耐干旱和品質改良轉基因玉米等方面[15]。

2.1 抗蟲轉基因玉米在玉米種植過程中，蟲害導致的玉米減產較為普遍，主要為棉鈴蟲、亞洲玉米螟和黏蟲的危害。為了減少化學防治帶來的環境問題，通過轉基因技術培育抗蟲轉基因玉米品種，保障玉米生產安全是一項重要的路徑[16]。陳沼汀等[17]選用玉米自交系H99 幼胚為轉化試驗材料，用農桿菌介導轉化法將抗蟲基因cry1Ab13導入到玉米基因組中，通過分子檢測和田間抗蟲鑒定，對玉米螟的抗性顯著提高。王建軍等[18]以鄭58 和昌7-2 玉米自交系為試驗材料，用花粉介導法將cry1Ac基因導入玉米基因組中，然后進行多代 PCR 檢測和Southern雜交分析，獲得純合的轉基因株系。在抗蟲轉基因玉米培育過程中，抗蟲的評價試驗是非常重要的環節，尤其是轉Bt玉米對于玉米螟、黏蟲、棉鈴蟲有一定的抗性，能夠抑制黏蟲生長發育[19]。同時還要根據不同玉米種植區害蟲發生情況實行分區域布局，研究進行管控的轉基因抗蟲玉米種植應對策略[20]。

2.2 耐除草劑轉基因玉米玉米在種植生產過程中與各種田間雜草爭奪水分和營養物質，導致其生長過程中的營養成分積累和產量受到抑制，因此，作為一種廣譜內吸傳導性除草劑，草甘膦是目前使用量最大的除草劑品種之一，而耐除草劑草甘膦轉基因玉米研究和應用是重要的轉基因玉米材料培育的方向[21]。耐草甘膦基因通常作為表達載體構建中的篩選標記基因，與其他目的基因同時實現遺傳轉化，能夠獲得復合性狀的轉基因玉米材料。余桂容等[22]以玉米自交系18599 和綜31 幼胚為轉化受體，通過篩選、檢測，獲得了耐除草劑和抗蟲的雙抗玉米親本育種材料。劉苗苗等[23]選用玉米Hi-Ⅱ為轉化受體材料，用農桿菌介導法將耐草甘膦基因G10ev導入受體材料基因組中并進行了抗性鑒定，培育出了具有自主知識產權的耐草甘膦玉米轉化系AG16。

2.3 耐旱轉基因玉米由于水資源的短缺，加之農業灌溉用水條件的不同，旱作農業的發展急需耐旱轉基因玉米品種的培育。相關研究表明，干旱每年導致作物減產達50%以上，隨著我國耐旱轉基因玉米的研究發展，耐旱基因主要分為轉錄因子、酶類和其他抗旱相關蛋白基因[24]。鄭成忠等[25]以T4轉BADH基因玉米自交系丹988 為材料，經過加代對T5和T6轉基因植株進行基因表達穩定性、生理生化指標測定、田間耐旱性分析，培育了耐旱玉米新種質資源。冷益豐等[26]研究了轉入抗旱基因TsDREB2A、CBF4和PIS的13 份玉米自交系種子材料的萌發期抗旱性。因此，耐旱基因的挖掘以及轉化玉米材料評價是培育耐旱玉米品種的有效途徑。

除此之外，品質改良轉基因玉米品種主要與抗蟲、耐除草劑的多基因聚合轉化，獲取復合性狀的轉基因玉米新材料。鄒俊杰等[27]研究了含有Cry3Bb、Cry1Ab、cp4epsps、ZmTMT和ZmHPT5個基因聚合的轉基因材料，具有抗蟲、耐除草劑和提高維生素E 含量等性狀的遺傳穩定性表達。將多基因聚合轉化和常規育種技術相結合，培育多種符合性狀的轉基因玉米材料具有重要的研究價值和廣泛的應用前景。

3 轉基因玉米檢測技術

轉基因玉米檢測技術主要有兩類，一是以核酸為檢測對象的PCR 法，包含普通PCR 檢測、多重PCR 檢測和實時熒光定量PCR 檢測；二是以蛋白質為檢測對象的檢測法，常用的有試紙條轉基因檢測。核酸檢測方法是應用PCR 技術開展轉基因玉米成分的檢測方法。陽麗等[28]根據常見的玉米內源基因CaMV35S啟動子和NOS終止子，轉化的外源目的基因設計檢測引物，通過優化檢測體系，建立PCR 初步的篩選檢測方法。尹全等[29]研究了轉基因玉米篩查的多重PCR 檢測方法，構建了進口轉基因玉米基因元件P-CaMV35S、P-ract1、T-NOS、pat、bar和PMI等元件的組合篩選檢測體系，對我國進口的轉基因玉米進行快速和有效的檢測。袁磊等[30]設計特異性引物和Taqman 探針，通過實時熒光PCR 技術建立玉米MON88017 特異性檢測方法，檢測結果的靈敏度和準確性都比較高，可以滿足國際上關于轉基因的1%檢測底限要求。作為蛋白質檢測方法的試紙條分為樣品墊、襯板、吸收墊、結合墊、NC 膜、檢測帶和控制帶，已經成為了商品化的試紙。檢測時將樣品研磨，溶解后獲取蛋白質溶液，再用試紙檢測讀取結果，轉基因檢測試紙在玉米轉基因檢測中應用非常方便，能夠顯著提高檢測效率。