PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的運(yùn)用

王忠桂

（河北綠農(nóng)檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司，河北廊坊 065400）

我國現(xiàn)階段的食品工業(yè)發(fā)展已進(jìn)入關(guān)鍵轉(zhuǎn)型升級(jí)期，由高速增長(zhǎng)階段邁向高質(zhì)量發(fā)展階段。食品的質(zhì)量安全作為人們生活中的首要問題，與人們的生活健康息息相關(guān)，逐漸成為社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)。食品安全是食品行業(yè)保持健康發(fā)展的基石[1]。食品生產(chǎn)過程中一旦發(fā)生微生物污染，將會(huì)對(duì)人體的健康產(chǎn)生危害。因此，需要加強(qiáng)食品中的微生物檢測(cè)來提升食品質(zhì)量安全[2]。PCR技術(shù)是一種較先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)，在多個(gè)領(lǐng)域均有較廣泛應(yīng)用，在食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域，PCR技術(shù)具有準(zhǔn)確性高、操作便捷的特點(diǎn)，可有效檢測(cè)食品中的微生物含量。因此，食品微生物檢測(cè)中需摒棄操作復(fù)雜且準(zhǔn)確率差的檢測(cè)方法，發(fā)揮PCR技術(shù)的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，提高食品微生物檢測(cè)的時(shí)效性和準(zhǔn)確性[3]。

1 PCR技術(shù)概述

1983年MILLUS博士發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)，該技術(shù)是一種能對(duì)生物體DNA進(jìn)行復(fù)制、擴(kuò)增的技術(shù)，可對(duì)特定生物體的特定DNA的序列進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增。PCR技術(shù)的DNA擴(kuò)增過程分為3個(gè)階段，即變性階段、退火階段、延伸階段。變性階段中將DNA雙鏈打開；在退火階段中將特性異物與打開的DNA單鏈進(jìn)行結(jié)合；在延伸階段中，使用DNA聚合酶以DNA單鏈為模板進(jìn)行DNA的合成，實(shí)現(xiàn)DNA分子的大量擴(kuò)增，從而獲得大量的DNA分子并進(jìn)行檢測(cè)分析[4]。PCR技術(shù)的特殊性在食品微生物檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用，通過PCR技術(shù)對(duì)食品中所含有的微生物的DNA進(jìn)行檢測(cè)，以確定食品中含有的微生物的含量和種類。PCR技術(shù)可以提高食品微生物的檢出率、時(shí)效性以及準(zhǔn)確性，及時(shí)排除食品微生物污染對(duì)人們健康的威脅，提高食物安全屏障。

2 PCR技術(shù)的應(yīng)用類型

2.1 普通PCR技術(shù)

通過PCR技術(shù)可以特異性地?cái)U(kuò)充待檢微生物的基因片段，以實(shí)現(xiàn)快速獲得檢驗(yàn)結(jié)果的目的，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，PCR技術(shù)具有操作便捷、靈敏度高的特點(diǎn)，檢測(cè)人員一般只要幾個(gè)小時(shí)即可完成食品微生物的測(cè)定工作。其缺點(diǎn)是在目前的實(shí)際應(yīng)用中，尚無法對(duì)待檢測(cè)樣品中的活體細(xì)胞和死亡細(xì)胞進(jìn)行鑒別，只能對(duì)已知微生物的核酸序列進(jìn)行測(cè)定。因此，還需要對(duì)食品中微生物對(duì)PCR技術(shù)的特異性反應(yīng)進(jìn)行更深入的研究。

2.2 多重PCR技術(shù)

多重PCR技術(shù)（Multiplex Polymerase Chain Reaction，mPCR）的工作原理是在同一PCR擴(kuò)增過程中加上兩對(duì)以上的引物，實(shí)現(xiàn)一次性完成多個(gè)核酸片段擴(kuò)增的目的，使檢測(cè)過程更加方便、快捷。例如，大腸桿菌、致病性弧菌和沙門氏菌等細(xì)菌就可以進(jìn)行同步檢測(cè)。與傳統(tǒng)檢測(cè)方法需大量生化實(shí)驗(yàn)相比，多重PCR技術(shù)可通過一次性擴(kuò)增來進(jìn)行批量檢測(cè)，實(shí)用性和應(yīng)用性較強(qiáng)。在食品微生物檢測(cè)工作中，結(jié)合國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，多重PCR技術(shù)可大量減少檢驗(yàn)工作量，縮短檢測(cè)時(shí)間，進(jìn)行快速初篩，在大幅提升工作效率的同時(shí)還可以降低檢測(cè)成本[5]。多重PCR技術(shù)的缺點(diǎn)是存在假陰性的情況。因此，需提升樣品質(zhì)量，排出干擾因子的影響，改進(jìn)樣品處理工作。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

熒光定量PCR技術(shù)（Quantitative Real-time PCR）屬于分子生物學(xué)范疇，因此該技術(shù)可以結(jié)合先進(jìn)生物技術(shù)進(jìn)行應(yīng)用，是在普通PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上利用熒光特性的不同進(jìn)行核酸定量測(cè)定，具有敏感度高、檢測(cè)范圍寬、穩(wěn)定性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，且該方法無需進(jìn)行PCR后續(xù)處理，可有效避免交叉感染，保障檢查結(jié)果的精準(zhǔn)性，目前在國內(nèi)外食品微生物快速檢測(cè)領(lǐng)域已廣泛應(yīng)用到熒光定量PCR技術(shù)[6]。但熒光定量PCR技術(shù)依然存在假陽性結(jié)果的缺點(diǎn)，且儀器設(shè)備昂貴，使用成本較高。

2.4 RT-PCR檢測(cè)技術(shù)

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）是一種更先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)，食品中所含有的大部分微生物種類均能使用該技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，且檢測(cè)準(zhǔn)確度高、靈敏性強(qiáng)，還可用于檢測(cè)食品中含有的不同微生物種類，對(duì)不同微生物的特征進(jìn)行區(qū)分。

3 PCR技術(shù)的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)

傳統(tǒng)食品微生物檢測(cè)一般采用顯微鏡直接觀察法和平板計(jì)數(shù)法，傳統(tǒng)檢測(cè)方法的工作原理是對(duì)活菌的總數(shù)進(jìn)行人工測(cè)定，以上兩種檢測(cè)方法具有設(shè)備簡(jiǎn)易、操作簡(jiǎn)單且成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用較為廣泛。但這兩種方法也存在明顯的缺點(diǎn)，其操作過程和結(jié)果較依賴于檢測(cè)人員的操作技術(shù)和鑒別能力，具有一定的主觀性，且整個(gè)檢測(cè)過程工作較煩瑣，試驗(yàn)周期較長(zhǎng)。因此，這兩種檢測(cè)方法難以保證其結(jié)果的客觀性、準(zhǔn)確性和時(shí)效性，特別是在進(jìn)行大批量檢測(cè)工作時(shí)，所需人力、物力較大且時(shí)效性非常差[7-8]，而使用PCR技術(shù)進(jìn)行食品微生物檢測(cè)，可快速得到檢測(cè)結(jié)果，時(shí)效性高且準(zhǔn)確率能得到保障。

3.1 操作流程便捷

傳統(tǒng)食品微生物檢測(cè)工作周期長(zhǎng)、時(shí)效性差、檢查結(jié)果具有主觀性、欠缺準(zhǔn)確度和整體工作效率較低。而應(yīng)用PCR技術(shù)只需一名工作人員即可進(jìn)行檢測(cè)工作，時(shí)效性和準(zhǔn)確率高。

3.2 準(zhǔn)確率高

食品中含有的微生物數(shù)量和種類較多，不同種類的微生物具有不同特征，造成檢測(cè)方法差異較大，傳統(tǒng)檢測(cè)方法難以對(duì)微生物種類進(jìn)行鑒別區(qū)別。PCR技術(shù)可依據(jù)其技術(shù)特點(diǎn)對(duì)微生物種類進(jìn)行有效鑒別與區(qū)分，是保障食品安全的重要技術(shù)。

3.3 時(shí)效性高

傳統(tǒng)食品微生物檢測(cè)技術(shù)對(duì)一般菌種的檢測(cè)需花費(fèi)2 d以上的時(shí)間才能得到檢測(cè)結(jié)果，時(shí)效性較差，對(duì)于突發(fā)性食品安全事件無法及時(shí)采取有效應(yīng)對(duì)措施，滯后的檢測(cè)結(jié)果會(huì)導(dǎo)致受微生物污染的食品流入市場(chǎng)，對(duì)消費(fèi)者的健康造成較大危害。PCR技術(shù)的檢測(cè)過程在1 d內(nèi)即可完成，可快速、及時(shí)地得到檢測(cè)結(jié)果，對(duì)指導(dǎo)食品安全生產(chǎn)以及保障消費(fèi)者的健康安全具有重要意義[9]。

4 PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中應(yīng)用

4.1 致病菌的檢測(cè)

在食品微生物檢測(cè)工作中，致病菌是一項(xiàng)重要檢測(cè)項(xiàng)目，傳統(tǒng)檢測(cè)方法操作過程較煩瑣，需進(jìn)行菌種培養(yǎng)、收集分離以及檢測(cè)等環(huán)節(jié)，檢測(cè)周期一般在5 d以上，限制了食品監(jiān)督部門的工作效率，而PCR技術(shù)可有效縮減致病菌檢測(cè)周期，提高食品監(jiān)督部門的工作效率。致病菌的檢測(cè)流程如下。①富集細(xì)菌，通過離心過濾等方式進(jìn)行細(xì)菌分離；②裂變過程，將獲得的DNA進(jìn)行檢測(cè)；③使用特異性核酸探針和電泳來完成檢測(cè)DNA序列的工作，最終確定病菌的數(shù)量和種類。PCR技術(shù)在致病菌檢測(cè)上始于沙門氏菌，目前對(duì)該病菌的檢測(cè)方案已較為成熟[10]。隨著技術(shù)發(fā)展，PCR技術(shù)也在不斷拓寬技術(shù)應(yīng)用范圍，不僅可以對(duì)沙門氏菌進(jìn)行有效檢測(cè)，還能應(yīng)用于金黃色葡萄球菌的檢測(cè)。

4.2 非致病菌的檢測(cè)

PCR技術(shù)可有效檢測(cè)食品中的非致病菌，但對(duì)于非致病菌的檢測(cè)范圍存在局限性，對(duì)食品中乳酸菌的檢測(cè)應(yīng)用較多。乳酸菌是一種分布廣泛的非致病菌，具有較高的生物學(xué)價(jià)值。研究表明，大部分乳酸菌有益于人體健康，少部分乳酸菌對(duì)消費(fèi)者健康存在危害。乳酸菌對(duì)各種生長(zhǎng)環(huán)境的適應(yīng)性較強(qiáng)，即使真空中乳酸菌也能生存。在食品生產(chǎn)中，乳酸菌應(yīng)用較廣，常作為添加劑來使用。部分乳酸菌可作為防腐劑，能顯著抑制食物腐敗過程，延長(zhǎng)食品保質(zhì)期。使用PCR技術(shù)對(duì)乳酸菌進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，需充分了解乳酸菌的知識(shí)背景和生產(chǎn)規(guī)律，能夠快速得到乳酸菌的菌落資料，然后進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，檢測(cè)其發(fā)酵過程，監(jiān)測(cè)食品在此過程中的腐敗程度，確定保質(zhì)期的有效性[11]。另外，PCR技術(shù)也可應(yīng)用于酸奶中的乳酸菌檢測(cè)且準(zhǔn)確度較高。

5 PCR技術(shù)應(yīng)用于食品微生物檢測(cè)所面臨的問題

食品生產(chǎn)過程中的微生物污染途徑較多，影響范圍也較大，是食品安全的關(guān)鍵問題。隨著社會(huì)發(fā)展，食品生產(chǎn)規(guī)模不斷擴(kuò)大，同時(shí)危害來源也不斷增多，微生物污染范圍廣且檢測(cè)范圍增大。在現(xiàn)有的技術(shù)水平和生產(chǎn)規(guī)模下，食品微生物的檢測(cè)工作也隨之增加，而檢測(cè)技術(shù)的欠缺，導(dǎo)致食品污染事件發(fā)生概率增大。

6 在食品微生物檢測(cè)中如何加強(qiáng)運(yùn)用PCR技術(shù)

食品檢測(cè)部門廣泛存在工作人員綜合能力素養(yǎng)水平不高的現(xiàn)象，因此應(yīng)注意人才引進(jìn)工作，尤其是針對(duì)PCR技術(shù)的培訓(xùn)工作需加強(qiáng)，才能提升檢測(cè)部門的工作效果和工作效率。加大檢測(cè)人員的培養(yǎng)和支持力度，完善PCR檢測(cè)技術(shù)的人才培養(yǎng)機(jī)制，重視檢測(cè)人員的專業(yè)技能培訓(xùn)，制定具體有效的培訓(xùn)方案，提升PCR技術(shù)工作人員的知識(shí)水平和技術(shù)能力，幫助檢測(cè)人員樹立正確的工作態(tài)度和理念，提升職業(yè)道德素養(yǎng)，更好地保障食品生產(chǎn)的安全。

7 結(jié)語

食品生產(chǎn)質(zhì)量安全工作與食品微生物檢測(cè)技術(shù)具有密切聯(lián)系，為了不斷提升食品微生物檢測(cè)的準(zhǔn)確性和時(shí)效性，更好地滿足人們對(duì)食品質(zhì)量安全的要求。我國正處于產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型時(shí)期，PCR技術(shù)的應(yīng)用仍處于發(fā)展階段，相關(guān)部門和企業(yè)應(yīng)注重提升食品檢測(cè)人員的綜合能力以及素養(yǎng)水平，提升對(duì)PCR技術(shù)的認(rèn)知，拓展對(duì)PCR技術(shù)的實(shí)踐、應(yīng)用能力，提高檢測(cè)工作的準(zhǔn)確性和有效性，使PCR技術(shù)發(fā)揮保障食品安全，維護(hù)良好的食品市場(chǎng)環(huán)境的作用。