蘋果及其制品中展青霉素研究進展

王利平，王麗霞，劉保友，張悅麗，張偉

(1.煙臺市福山區農業技術推廣中心，山東煙臺 264000；2.山東省煙臺市農業科學研究院，山東煙臺 265500；3.煙臺市科技館，山東煙臺 264001；4.煙臺大學生命科學學院，山東煙臺 264005；5.山東省農業科學院植物保護研究所，山東濟南 250100)

中國蘋果及其制品在世界蘋果產業中占有極其重要的地位。在采后流通儲存階段，蘋果在合適的溫濕度條件下易受到病原菌，尤其是可產生高毒性毒素的真菌侵染，不僅對蘋果產業造成巨大損失，而且嚴重威脅消費者的身體健康[1]。其中，青霉屬真菌(Penicilliumspp.)是主要的病原菌之一，對蘋果及其制品的侵染嚴重[2,3]。該屬真菌會產生一種稱為展青霉素(Patulin，PAT)的真菌毒素，具有“三致”效應的負面影響[2,4]，被國際癌癥研究機構(IARC)歸為第三類可疑致癌物質[5]。展青霉素對中國蘋果及其制品的質量安全已造成嚴重影響。筆者就展青霉素產生菌、理化性質及毒性、污染現狀、降解及檢測方法等作了介紹，旨在對蘋果及其制品中展青霉素的研究及防控提供參考。

1 展青霉素產生菌

展青霉素又稱棒曲霉素，1941年由Glister首先發現并分離純化，命名為Patulin(Pat)。主要由青霉屬(Penicillium)的擴展青霉(P.expansum)、產黃青霉(P.chrysogenum)、展青霉(P.patulum)、園弧青霉(P.cyclopium)、常現青霉(P.frequentan)、殼青霉(P.crustosum)、婁地青霉(P.roqueforti)、棒形青霉(P.claviforme)、新西蘭青霉(P.novae-zeelandiae)、灰黃青霉(P.griseofulvum)、石狀青霉(P.lapidosum)、粒狀青霉(P.granulatum)、梅林青霉(P.melinii)、產黃青霉(P.chrysogenum)等，以及曲霉屬(Aspergillus)的棒曲霉(A.clavalus)、土曲霉(A.terreus)、巨曲霉(A.giganteus)，絲衣霉屬(Byssochlamys)的雪白絲衣霉(B.nivea)等菌株產生[6-10]。目前蘋果及其制品中最常見的展青霉素產生菌為擴展青霉。

2 展青霉素的基本性質與危害

展青霉素的分子式為C7H6O4，屬雜環內酯類物質，其固體為無色狀，易溶于氯仿、乙醇、丙酮、水等溶劑，在酸性環境中非常穩定，在堿性條件下活性降低[11-14]。

20世紀40年代研究表明，展青霉素可抑制細菌生長并對治療感冒有效果[3]。但隨后研究明確其對動物和高等植物具有毒害作用，于20世紀60年代將其劃分為毒素[15]。世界衛生組織(WHO)認為展青霉素具有較強的基因毒性，國際癌癥研究機構(IARC)將其歸為第3類致癌物。1984年，北京西郊某牧場奶牛反應過敏和肌肉震顫，就是因為食用了以棒曲霉為優勢菌的霉變芽根[16]。展青霉素具有較強的急性毒性，嚙齒動物的半致死劑量(LD50)為20～100 mg/kg，家雞為50～170 mg/kg[2]。Smith等發現將老鼠胚胎置于濃度為47～55 μmol/L的展青霉素環境下，核酸、蛋白質、體細胞數等顯著降低；當展青霉素濃度增加至62 μmol/L時，胚胎40 h內死亡[17]。展青霉素可影響雞胚的正常發育，孵化出的小雞具有眼突、爪外張等不良癥狀[1]。有報道稱，給2個月的雄性大鼠皮下注射展青霉素，每周2次，每次0.2 mg，從58周起在注射部位產生局部肉瘤[18]。展青霉素還可能通過線粒體途徑引起人胚腎細胞293凋亡[19]。

3 展青霉素在蘋果及其制品中的污染現狀

展青霉素存在于霉爛蘋果及其制品中，與鏈格孢毒素、赭曲霉毒素、黃曲霉毒素被認定為世界果品中最為重要的毒素類別。病菌經氣孔或表面傷口侵入蘋果表皮并在適合條件下繁殖，進一步侵染到周圍的健康果肉組織[20]。若采用被病菌侵染的果實作為加工原料，展青霉素就被帶入產品，造成毒素污染并長期穩定存在[21,22]。新鮮水果中很少有展青霉素產生，但新鮮水果中多能分離得到青霉菌或曲霉等展青霉素產生菌[8]。有些蘋果制品是僅靠肉眼剔除了腐爛部分保留無病斑部分加工制成的，而此時展青霉素產生菌的菌絲可能已經侵染但還未使蘋果表現病變癥狀，毒素已經存在。蘋果果實腐爛病斑處，展青霉素最大含量可達1 000 μg/kg；蘋果汁中含量達0.5～1 150 μg/kg；整果平均含量可達21～746 μg/kg；采用腐爛蘋果作為原料制成的產品中可達0.79～140 μg/kg[23,24]。李秀芳等對中國4個地區的62份霉爛蘋果和梨進行了霉菌分離鑒定和展青霉素的測定結果表明，各地區蘋果中展青霉素的主要產毒菌是擴展青霉[25]。

4 展青霉素及其產生菌的降解和防控

對展青霉素的防控研究主要集中在兩個方面：在果品生產、貯運過程控制展青霉素產生菌的生長繁殖及產毒；在加工過程中對已產生的毒素進行降解與消除。

展青霉素的降解消除通常采用的物理方法包括吸附法、微波法、超聲波法、紫外輻照法等，可將真菌毒素污染水平降低，但不能完全脫除。如硅膠能夠較好地脫除蘋果汁中的展青霉素；超聲波功率490 W時，展青霉素的降解率最高，超聲波波頻率45 kHz時對展青霉素的降解效果最佳[26]。Liu等制備了摻有GO-SH的氣凝膠，可使蘋果汁中的PAT降低(89±1.23)%，且不會引起果汁品質惡化和細胞毒性[27]。通過添加誘抗劑、殺菌劑等化學試劑可控制病菌生長或消減毒素量[28]。葛永紅等用1%檸檬酸誘抗劑能顯著降低損傷接種蘋果果實P.expansum病斑直徑，提高果實過氧化物酶等酶的活性和品質[29]。丁香精油、大蒜精油、百里香精油、薰衣草精油也可抑制擴展青霉的孢子萌發[30,31]；茶多酚及香草酸能有效抑制擴展青霉[32]；另外臭氧處理是高效、安全、低廉的展青霉素降解方法，且殺菌性強，不產生二次污染。殺菌劑等物質嚴格按說明使用，注意安全間隔期，可保障果品安全生產及人身健康[33]。從安全方面來看，真菌菌素的毒性比絕大多數殺菌劑等物質的毒性高得多。因而，當前及今后較長時期，化學防治仍是病害防控及其毒素控制的主要方法。目前生物學方法主要包括微生物降解和拮抗作用，其中酵母是目前研究最多的微生物資源，1977年就報道通過酵母發酵可降解90%的展青霉素[34]。國內外很多研究發現酵母菌和乳酸菌對展青霉素具有良好的降解、去除作用[4,35-38]。孫藝文等發現，擬粉紅鎖擲孢酵母(Sporidioboluspararoseus)代謝產生的胞內酶可以降解展青霉素，顯著降低蘋果傷口處展青霉素的積累量[39]。付瑞敏等[40]研究表明，生防菌海洋解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)BA-16-8抑制擴展青霉的關鍵物質是脂肽類抗生素 Fengycin，通過抑制6-MSAS基因表達而抑制展青霉素的合成，經處理后，單位質量的擴展青霉菌絲體中展青霉素的積累量顯著下降。鑒于生物防治對環境低污染甚至無污染、對人畜風險低等優點，未來作為控制真菌毒素的主要技術潛力巨大。

5 展青霉素的檢測方法

薄層色譜法最早用于檢測水果中展青霉素的含量[41]，但由于薄層色譜法操作繁瑣、檢測精確度低、可重復性和再現性差，目前已不再使用。2017年6月23日實施的GB 5009.185 -2016 《食品安全國家標準 食品中展青霉素的測定》刪除了薄層色譜法，增加了同位素稀釋-液相色譜串聯質譜法和高效液相色譜法。Tarter等首次采用七氟丁酰衍生化毛細管氣相色譜-電子捕獲法測定蘋果汁中展青霉素的含量，采用乙酸乙酯萃取，電子捕獲檢測器在0.05～0.50 ng的范圍內成線性，總方法平均回收率為84%，氣相色譜檢測限≤10 pg/L，且方法靈敏、重復性高[42]。毛艷玲等采用氣相色譜-質譜法對蘋果樣品中展青霉素進行分析測定，表明該方法操作步驟簡單、試劑用量少，處理時間短[43]。

最常用的定量分析毒素的方法是高效液相色譜法，通過反相C18柱將毒素與干擾物羥甲基糠醛分離，再經熒光、紫外或質譜檢測，具有很高的穩定性、選擇性和靈敏度。展青霉素是極性小分子量物質，其紫外吸收光譜強，適合用高效液相色譜法進行檢測。殷居易、張苗等采用高效液相色譜法測定了濃縮蘋果汁中展青霉素的含量，表明該方法操作簡單、快速、準確靈敏[44,45]。孟瑾等采用高效液相色譜法測定結果表明，山楂汁和蘋果汁中展青霉素檢出限分別為8 μg/L和7 μg/L[46]。

隨之，更多研究者改進了高效液相色譜測定展青霉素的方法。Vural等采用乙酸乙酯提取樣品、碳酸鈉溶液萃取，建立了快速、簡便、經濟的反向液相色譜法測定蘋果汁中展青霉素的方法，其回收率高于98%，檢出限小于5 μg/L[47]。Jalali等利用紫外檢測器對伊朗150份商用蘋果汁中的展青霉素進行高效液相色譜分析，采用C18-SPE柱凈化樣品，平均濃度為26～92 μg/L，靈敏度和回收率均可滿足檢測分析的需求[48]。Sewram等通過大氣壓化學電離模式液質聯用方法測定了蘋果汁中的展青霉素，該方法具有靈敏度高、回收率高、檢測限低至10 mg/L的特點，且對加標蘋果果汁樣品的檢測限為4 mg/L[49]。

最近，更多的色譜串聯技術被用于檢測展青霉素。Li等建立了山楂和蘋果飲料中展青霉素的固相過濾柱和液相色譜法(UPLC-MS/MS)檢測方法，在保證準確度和精密度的前提下，4 min內即可完成樣品中展青霉素的檢測[50]。項瑜芝等建立了同位素稀釋高效液相色譜法對蘋果汁、蘋果醋和蘋果醬等30份樣品中的展青霉素進行測定，展青霉素在5～250 mg/L濃度范圍內線性關系良好，回收率90%以上，可以滿足GB 2761 - 20112017《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》對于水果制品、果蔬汁和酒類(僅限蘋果和山楂)中展青霉素殘留的檢測要求[51]。Li等采用同位素稀釋液相色譜-串聯質譜法(ID-LC-MS/MS)測定蘋果汁中的展青霉素，檢測限低至0.2 μg/kg，在1～400 μg/kg范圍內建立了基質匹配線性(r2= 0.9997)，回收率97.2%以上[52]。馬雪濤等采用分子印跡親和固相萃取技術進行樣品前處理、液相色譜-串聯質譜檢測果蔬制品中展青霉素，能夠很好地排除復雜樣品中的假陽性現象，提高了檢測準確性[53]。David等應用在線分子印跡聚合物固相萃取微芯片在毛細管電泳和質譜聯用測定展青霉素，檢測限為1 μg/kg，線性范圍為1～100 μg/kg[54]。Shukla等成功地合成了一種不需要生物或化學受體或特異性抗體的還原性氧化石墨烯/氧化錫(rGO/SnO2)復合材料，電化學傳感器能夠快速檢測蘋果汁樣品中的展青霉素，而無需提取或凈化步驟，在短時間內的回收率(74.33±0.70～99.26±0.70)%高于高效液相色譜法(61.97±1.78～84.31±1.96)%[55]。

6 結論及展望

展青霉素具有急性毒性、基因毒性、致畸性和致癌性，目前世界各國已意識到展青霉素對人類健康存在潛在威脅，并制定了相關限量標準來限定水果及其相關制品中的展青霉素含量。歐盟(EU)規定展青霉素的最大限量在果汁產品或飲品中為50 μg/kg、在蘋果肉產品中為25 μg/kg、標簽為嬰兒產品的為10 μg/kg。世界衛生組織(WHO)規定蘋果汁中展青霉素的最高限量標準為50 μg/kg。中國現行食品安全國家標準GB 2761 - 2017規定蘋果、山楂果汁展青霉素限量為50 μg/kg[56]。今后還需要對檢測技術深入研究，進一步降低毒素的檢出限，提高檢測精密度，建立展青霉素在蘋果及制品中的檢測方法，同時深入開展毒素毒理學研究，為更科學地制定展青霉素限量標準提供依據。