石斛內生菌的研究進展

劉 雪

（濟南市食品藥品檢驗檢測中心，山東濟南 250000）

石斛（Dendrobium）為附生型多年生草本植物，為蘭科最大的屬之一，主要有鐵皮石斛、流蘇石斛、環草石斛、金釵石斛、鼓槌石斛和黃草石斛等，在我國主要分布于秦嶺-淮河以南，集中在云、貴、桂、瓊、粵和臺等地區。石斛是傳統名貴藥材，《神農本草經》記載其“味甘，平”“久服厚腸胃，輕身延年”。2020版《中國藥典》記載，石斛具有益胃生津，滋陰清熱的功效。現代科學研究證明石斛含有豐富的多糖、生物堿、黃酮、倍半萜類和菲類等活性成分，在抗氧化、抗衰老、抗腫瘤和增強抵抗力等方面作用顯著。因其良好的食用和藥用效果，石斛被國家藥監局列入“藥食同源”名單。

植物內生菌是指在其生活史的一定階段或全部階段生活在健康植物的各種組織和器官內部，對寄主植物產生直接或間接作用，不會引起明顯病害的一類微生物群。石斛內生菌是影響石斛生長與藥效的重要生態因素之一，近年來學者對石斛內生菌的分離鑒定及其與石斛的互惠共生關系進行研究，取得了較為豐富的成果。

1 石斛內生菌

石斛內生菌資源豐富，在植株的根莖葉中都有分布，目前研究主要集中于鐵皮石斛、霍山石斛、金釵石斛、齒瓣石斛、束花石斛、美花石斛和細莖石斛等藥用石斛方面。不同石斛由于品種及生存環境等差異，其內生菌的種類和數量差別較大，野生石斛內生菌物種多樣性指數高于人工栽培品種。

1.1 石斛內生真菌

自20世紀發現石斛內生菌開始，學者先后從鐵皮石斛、美花石斛、金釵石斛等石斛中分離出眾多內生真菌，形成了較為成熟的分離鑒定方法[1]。石斛內生真菌的種群豐富多樣，主要有擔子菌亞門、子囊菌亞門和半知菌亞門，涵蓋小菇屬、絲核菌屬、木霉屬、柱孢霉屬和頭孢霉屬等近60個屬[2]。石斛內生真菌有一定的宿主及組織特異性，不同品種及同一品種不同組織中的內生真菌差異較大。嚴亮等[3]研究云南栽培的鐵皮石斛，發現其根部的內生菌的種類、數量最多。有學者從金釵石斛中發現14個屬的內生真菌，且在葉組織中分布數量最多[4]。柴曉蕾等[5]研究華石斛野生植株內生真菌，發現葉中分離出的菌株數最多。這些差異可能與宿主石斛的基因、生長環境、生長年限等因素有關，也可能與篩選方法等操作因素有關。

1.2 石斛內生細菌

石斛內生細菌主要有厚壁菌門、放線菌門、變形菌門、擬桿菌門和梭桿菌門，涵蓋芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、土壤桿菌屬、假單胞菌屬、伯克氏菌屬、短小桿菌屬等近50個屬，在多個石斛品種中，芽孢桿菌屬和短芽孢桿菌屬為優勢菌群。研究表明，石斛內生細菌表現出地區、種屬特異性及組織偏嗜性，與藥材的道地性相符合。童文君等[6]從不同產地美花石斛的不同部位中分離出內生細菌67株，分布情況為莖部多于根部和葉部，來自廣西的種類數多于云南和廣東。王明月等[7]對人工種植的鐵皮石斛研究發現，其根組織中內生細菌數量高于莖和葉，且格氏沙雷氏菌和蘇云金芽孢桿菌僅存在于根組織。

1.3 不可培養內生菌

由于培養條件等因素限制，傳統方法只能篩選到植物內生菌的1%左右。隨著現代分子生物學技術的發展，DNA測序、熒光標記、酶聯免疫反應等技術在內生菌的鑒定、“不可培養內生菌”的研究方面實現了新突破。通過高通量測序可構建不同品種石斛的內生菌cDNA文庫，使篩選更準確、高效。有學者通過MiSeq高通量測序技術分析鐵皮石斛的內生細菌，檢測到低豐度的、從未分離鑒定過的瘤胃球菌屬、布赫納氏菌屬等細菌類群[8]。通過微生物多樣性測序技術，王珊珊等[9]從6種石斛莖部組織中檢測到從未報道過的叢毛單胞菌屬及羅爾斯通菌屬菌株。分子生物學技術尤其是DNA測序和基因圖譜等技術為石斛內生菌的研究提供了新的思路和方向。

2 石斛內生菌的作用

2.1 促進石斛植株的生長發育

石斛作為蘭科植物，種子沒有胚乳，其生活史與微生物的共生關系十分緊密。在長期的系統演化過程中，內生菌既可產生植物激素、維生素等促進石斛的生長發育，又可增強石斛對水分和礦質元素的吸收。在鐵皮石斛、金釵石斛、齒瓣石斛等篩選到的多種內生菌都對石斛的萌發、生長有顯著促進作用。SHAH等[10]從細莖石斛中分離到內生真菌R10，研究發現其能產生相對較高的植物生長素吲哚乙酸。金輝等[11]將內生瘤菌根菌人工接種至鐵皮石斛的組織培養苗，發現接菌苗的B、Fe、Cu和Mn等多種營養元素含量有所增加，其中B、Si元素含量分別增加了7.8倍和5.3倍。把從野生鐵皮石斛中分離的內生菌接入人工栽培植株，可提高栽培鐵皮石斛內生菌多樣性，還能使石斛在轉錄水平上的代謝途徑發生基因差異表達。

2.2 增強石斛的抗逆性

石斛內生菌能夠增強宿主植物抵抗病原菌和抗干旱能力。部分石斛內生菌有較強的抗病原菌能力，金釵石斛和流蘇石斛中均發現能產生廣譜抗菌活性物質的內生細菌。朱江敏等[12]發現石斛內生木霉菌能夠抑制病原真菌鐮刀菌，能有效提高石斛抗病能力。除通過分泌抗生素類物質外，石斛內生菌還能通過產生水解酶、毒性生物堿，或者生態競爭營養等途徑實現抗病性，是研發新型天然抗生素的寶貴資源。研究發現美花石斛的內生菌有較廣的pH適應范圍，還能誘導石斛產生能參加抗性反應的小分子酚類化合物，從而抵抗惡劣環境，這也是多數石斛能生長在樹皮上、石灰巖基質中的重要因素。

2.3 促進石斛活性代謝產物的合成

藥用石斛中生物堿、多糖、黃酮類和聯芐類是主要的次生代謝產物，研究發現內生菌能夠影響宿主石斛的次生代謝水平、誘導次生代謝產物的合成。CHEN等[13]發現石斛內生菌小菇屬MF24菌株和瘤菌根屬MF15菌株可使金釵石斛的多糖含量分別提高76.7%和153.4%。WU等[14]從鐵皮石斛分離內生菌并用其侵染栽培植株，明顯提高了栽培植株莖部的多糖及葉部的酚類、黃酮類的含量。用石斛內生菌MF23侵染金釵石斛后，可通過調節甲羥戊酸途徑中與生物堿合成相關的基因的表達，增加金釵石斛生物堿的合成[15]。研究認為內生菌通過一種化學信號誘導因子，能快速且特異性地誘導石斛植株特定基因表達、激活特定次生代謝途徑，促進相應成分的合成和積累。

2.4 產生其他功能性產物

現代研究證明石斛內生菌能產生多種功能性產物，石斛內生菌具有與藥用石斛相似的鎮痛消炎作用，從石斛內生菌石斛小菇發酵產物中提取出有明顯鎮痛作用的單體化合物β-谷甾醇和麥角甾烯氧化物。WU等[16]研究發現分離自鐵皮石斛內生真菌DO14代謝產物的5種化合物，對兩種人癌細胞（LOVO細胞、HL-60細胞）有不同程度的抑制作用。有的內生菌可以代謝出天然色素，如鐵皮石斛內生真菌H1B1可分泌耐高鹽高糖的水溶性紅色素[17]。多樣性的代謝產物對醫藥資源及工業生產具有重要研究價值。

3 結語

石斛內生菌在宿主石斛的生長及代謝中起著不可替代的作用，加強對內生菌的研究利用對保護石斛資源、拓寬其生物多樣性具有重要意義。目前，石斛及其內生菌相互作用機制、多種內生混合菌株的協同機制尚不明確，有效利用內生菌資源提高石斛的品質有待繼續探究，其在石斛內生菌代謝產物的藥理作用、有關功能基因的克隆與表達、大規模發酵培養提取相關功能性成分等方面，將有重要的理論和現實意義。