實時熒光定量PCR技術在轉基因食品 檢測領域中的應用

郭宇晴

（深圳市計量質量檢測研究院，廣東深圳 518000）

隨著科技的飛速發展，我國轉基因技術趨于成熟，在食品生產的多鏈條環節中發揮著重要作用。但是，轉基因食品在滿足食品供需及經濟效益的同時，也可能在食品基因改造過程中帶來安全隱患，威脅人們的身體健康。現階段，我國對轉基因食品安全性評價方面有著明確的規定，其中《農業轉基因生物安全評價管理辦法》明確要求，我國境內全部從業轉基因生物研究、生產等工作的組織都必須進行安全評價工作。為了能夠更清楚地了解轉基因食品的安全質量，我國對此類食品進行特殊監管，并運用科學有效的方式進行成分檢測，以保障食品安全性和規范性。其中，聚合酶鏈式反應技術（Polymerase Chain Reaction，PCR）是非常常見的一種。該技術可以根據對熒光信號的分析，獲取生物性狀中相關成分的含量情況。由此可見，研究熒光定量PCR技術在轉基因食品檢測領域的運用對于食品行業的可持續發展以及保障人們食品安全來講尤 為重要。

1 實時熒光定量PCR技術的基本原理

1.1 實時熒光定量技術的產生

PCR技術現已被廣泛應用在食品成分檢測工作中，但仍存在很多問題，其主要體現在以下幾個方面：①難以確保數據的精準度；②很容易在檢測的過程中出現數據不符、假陽性等狀況；③PCR技術主要使用的是轉基因技術最終的產品。針對以上情況，相關人員進行了優化與完善，實時熒光定量技術便應運而生。在PCR設備上安裝檢測裝置，可以在檢測過程中精準地分析產品中的EB參數，為后續檢測工作提供數據支持。

定量PCR技術在傳統工作原理的基礎上，對DNA、雜交等技術進行了融合，可以實時監測PCR參數進而分析熒光信號的強弱情況。目前，該技術在優化與完善的過程中，已逐漸趨于成熟，不僅能夠進行定量分析，還能夠充分發揮高靈敏度等優勢，進而更好地應用在生物、食品檢測工作中。

1.2 熒光共振能量轉移原理

實時熒光技術的工作原理是熒光共振能量轉移，具體指當熒光基因與基團之間存在一定距離時便會出現能量轉移，并在光的作用下呈現熒光反應，若基團與淬滅基因產生了分離，則不會繼續產生熒光。在此基礎上，要求工作人員在進行檢測前選擇合理的基團，并有針對性地應用該技術[1]。

1.3 定量原理

1.3.1 基本原理

在PCR技術應用過程中，DNA參數會隨著反應循環數上升，技術人員不僅可以利用熒光信號原理對數據變化進行分析，還可以對DNA模板進行定量分析。熒光閾值是指將PCR技術應用之前的熒光信號作為基礎信號，通常來講，其初始設置是5～15個循環熒光信號標準差的倍數。在具體工作中，會將檢測出的熒光信號作為可信信號，進而確定一個Ct參數，也就是技術應用過程中的閾值循環。不同的Ct值參數與模板之前的拷貝對數呈反比關系。因此，在具體工作中，可根據起始拷貝情況制定出標準曲線，若是已知Ct值則也可計算出拷貝數。

1.3.2 常用方法

從化學的層面來看，PCR技術可分為探針與非探針兩種，前者指利用探針對產物增加情況加以體現，而非探針則是利用熒光染料。其中SYBB Green染料是一種有效的熒光顏料，在檢測出dsDNA時會產生顏色。在性狀分開的環境中，則不會出現熒光反應。對于延伸情況來講，技術人員通過對反應液的檢查分析熒光信號強度，但這種檢測形式很容易出現假陽性，因此需要對精準度進行科學管理。

CSMV探針方式則是使用熒光物質進行檢測，通常情況下，5端的熒光基團會在探針使用過程中被分離，進而產生熒光，通過對熒光強度的檢測可以清楚了解產物增量狀況。現階段這種技術雖能滿足需要，但成本較高，且容易受其他外在因素影響。除此之外，實時熒光定量PCR檢測方式還包括分子信標檢測等。

2 實時熒光定量PCR技術在轉基因食品檢測中的應用

2.1 相對定量與絕對定量

PCR技術現已在轉基因食品檢測中被廣泛應用，但不同國家所制定的閾值情況有一定差別。在實時熒光技術的應用過程中，需先進行定量處理，其中相對定量指待測樣本中靶序列相對于另一種參照數量之間的變化情況，根據定量的形式則可以更快確定Ct值。在具體工作中，可以通過比較Ct值的方式進行定量分析，該方法是指在同一環境下進行PCR測試，通過對比兩個PCR反應中的Ct數據值，判斷轉基因產品中的成分含量。在測試工作中運用比值法可減少標準曲線建立的難度，但由于這種方式是以靶基因與內源控制物的擴增情況為基準，對拷貝數進行合理估計，在實際工作中，所得數據通常會大于實際情況，可能存在一定的誤差[2]。

絕對定量是指根據已知曲線情況推斷樣本量情況。與相對定量不同，絕對定量需要工作人員先根據相關數據構建體外轉錄系統，完成后根據系統的運用了解拷貝數情況，以構建曲線。此過程中標準品既可以為dsDNA，也有可能是合成DNA，能確保數據的真實性和準確性。最為常見的標準品是質粒DNA，可在對樣品進行處理后進行PCR反應。將拷貝數作為X值，Ct值為Y值便可以繪制標準曲線。在定量過程中，若無法確認數值，則需根據樣品的Ct數值，判斷標準樣品中的拷貝數。雖然這一技術形式難度較大，但近幾年來應用效果依舊較好。

2.2 選擇目標序列

轉基因檢測過程中的定量分析通常是針對轉基因生物中的外源序列，包括多種數據參數，例如目的基因等。針對不同種類的生物情況，轉基因產品的PCR監測形式不同。

通用序列是指調控基因序列，包括CaMV35S等，但這種形式由于經常被應用于轉基因食品中，且很多序列情況在自然情況下便存在，因此只是作為一種初步測試形式。而基因特異性則是指基因內部序列的一種，是一種天然的基因序列，是最為常見的一種基因檢測方式，但不同外部基因在植物生長過程中體現的形式存在一定的差異，因此這種特異性的檢測方式不能在相同形狀中的轉基因植物中檢測使用。結構特異性序列是指連接外源基因中的區域序列，具有較強的特異性特征，但由于相同基因的表達載體在轉化的過程中有多種拷貝形式，在植物基因檢測的過程中往往也會存在相似的轉基因品系，以至于這種形式不能應用在具有相同性狀的轉基因植物中[3]。

品系特異性序列是指外界序列形式與轉基因植物中的一種基因邊界序列，是外部基因與植物基因之間的一種區域序列，且序列形式是單拷貝形式，因此在使用過程中在精準度方面具有顯著的優勢。目前，為了降低轉基因檢測過程中基因選擇等方面的難度，降低出現假陽性的概率，品系特異性序列的檢測形式被廣泛應用。

3 實時熒光定量PCR技術在轉基因食品檢測工作中的發展形勢

實時熒光PCR技術的應用已經能夠攻克大多數轉基因檢測工作中的難點，應用前景較為良好。現階段，很多技術人員利用軟件對PCR技術應用數據進行實時檢測與分析，從根本上提升數據的精準度。在此過程中，多類PCR儀器也逐漸出現在市場中，短時間內便可完成樣品檢測。

在轉基因檢測技術不斷發展的過程中，轉基因產品種植范圍也越來越大，市場占比也隨著增大。因此，必須要確保檢測方式的運用質量，同時要求制定一套完善的質粒標準體系，針對過去的體系內容進行優化與完善。過去，PCR技術運用中需制作標準品進行檢測對比，而標準品的制作通常是將轉基因與非轉基因材料進行調和配制而成。目前，市場上最常見的產品是轉基因玉米、大豆等，隨著植物種類增加，很多標準品的構建已經變得越來越難，在一定程度上影響了轉基因研究工作的進行。此外，傳統的標準品通常只能進行單體基因情況測定，而質粒體系的建立可制造更符合條件的質粒標準品，為后續監測工作提供幫助[4]。

實時熒光定量PCR技術可在運用過程中打破傳統測定技術中轉基因食品定量測定方面的阻礙，進而從原有的相對變量檢測形式向更加精準的絕對變量轉變。但在技術發展過程中，由于基因技術應用的復雜性，很多新型的復合狀轉基因產品也已經出現。此外，傳統的檢測技術在標準品制作方面通常會針對一種成分進行檢測，因此在未來技術運用過程中也需加大對質粒標準品的重視。總而言之，當前轉基因食品檢測中運用PCR技術可將檢測工作從定性提升至定量，以達到成分檢測的目的。未來要不斷對轉基因食品檢測技術進行優化與升級，提升對成分檢測的精準度，進而為轉基因食品產業提供安全保障[5]。

4 結論

綜上所述，實施熒光定量PCR技術對于食品成分檢測來講非常重要，不僅能提高檢測效率，還能精準進行成分監測，進而服務市場監管與提升食品產業化。未來，政府部門及相關機構需進一步加大對該技術的運用，助力轉基因食品檢測工作高質量發展，為我國轉基因食品安全監管保駕護航。