基于NLRP3通路研究miR-155對THP-1巨噬細胞炎癥反應的調控作用

寧曉縣，申元英，郭 樂

（大理大學基礎醫學院，云南 大理 671000）

炎癥是機體對損傷因素產生的一種以防御為主的特異性免疫反應，能消除有害刺激，啟動愈合過程。然而炎癥反應失控時，會損害正常組織，引起糖尿病、關節炎等慢性炎癥性疾病〔1-2〕。活化的巨噬細胞貫穿于炎癥性疾病的整個過程，會誘發“炎癥風暴”，造成機體嚴重損傷〔3〕，因此探索巨噬細胞介導的炎癥反應分子機制有助于炎癥性疾病的治療。目前體外實驗獲取人源性巨噬細胞的主要方法是使用佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）誘導人單核細胞白血病細胞株THP-1，進一步用脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）刺激，極化為M1型巨噬細胞，分泌大量促炎因子〔4-5〕。

巨噬細胞中的核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide binding oligomerization domainlike receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體可被LPS激活〔6〕。NLRP3炎癥小體由NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1）組成，其激活有3個步驟：首先，刺激信號激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路，使NLRP3和白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）前體等蛋白的轉錄和表達增強；其次，NLRP3寡聚化并與ASC作用，啟動炎性體形成；最后，NLRP3炎癥小體募集并激活Caspase-1前體，使之活化為Caspase-1，剪切、加工IL-1β前體和白細胞介素18（interleukin-18，IL-18）前體，使之分別轉化為具有生物活性的IL-1β和IL-18，釋放到胞外，最終促進炎癥反應〔7-9〕。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類由內源基因編碼且高度保守的單鏈非編碼小分子RNA，主要參與基因的轉錄后調控〔10〕。miR-155是一種典型的多功能miRNA，參與炎癥、病毒感染、免疫等多種生理和病理過程〔11〕。研究〔12〕發現，miR-155可以靶向抑制THP-1巨噬細胞中NF-κB抑制蛋白E發揮促炎作用。然而，目前尚不清楚miR-155調控THP-1巨噬細胞炎癥反應是否與NLRP3炎癥通路相關。因此，本研究以LPS誘導THP-1巨噬細胞構建炎癥損傷，基于NLRP3通路探討miR-155的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料人單核細胞白血病細胞株THP-1（上海中科院細胞庫，批號：TCHu 57）；PMA（大連美侖生物技術有限公司，批號：MB5349-1）；LPS（愛必信生物科技有限公司，批號：055：B5）；RPMI1640培養基（江蘇康寧生物技術有限公司，批號：10-040-CVRC）；胎牛血清（美國Gibco，批號：10270106）；TRIzol試劑（美國Molecular Research Center，批號：TR118）；RNA逆轉錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號：R323、Q711）；miRNA逆轉錄試劑盒、miRNA實時熒光定量試劑盒（天根生化科技有限公司，批號：KR211、FP411）、miRNA-155模擬物（上海生工生物工程股份有限公司）；Lipofectamine TM 2000轉染試劑（Thermo Fisher Scientific，批號：11668019）；RIPA裂解液（上海碧云天生物技術有限公司，批號：P0013C）；PBS、PBST緩沖液、5×蛋白上樣緩沖液（北京索萊寶科技有限公司，批號：P1020、T1031、P1040）；BCA蛋白濃度測定試劑盒、超敏ECL化學發光試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號：P0010、P0018）；10% PAGE凝膠快速制備試劑盒（上海雅酶生物醫藥科技有限公司，批號：PG112）；兔抗GAPDH抗體、兔抗NLRP3抗體、兔抗Caspase-1抗體、二抗（美國Cell Signaling Technology，批號：2118、13158、3866、7074）；PVDF膜（BIO-RAD，批號：1620177）；StepOnePlus實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；多功能酶標儀（美國Bio-Rad公司）；迷你垂直電泳儀、迷你轉印槽（韋克斯科技有限公司）；化學發光成像系統（美國GE ImageQuant LAS4000）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養RPMI1640培養基中加入10%胎牛血清培養THP-1細胞，將其置于37℃、5%CO2培養箱，細胞密度達80%~90%時，傳代培養。

1.2.2 炎癥模型構建THP-1細胞處于生長旺盛期并且狀態良好時，以1×105個/mL的密度接種于48孔板中，PMA（100 ng/mL）刺激48 h，誘導分化為巨噬細胞；LPS（100 ng/mL）刺激1.5 h，構建炎癥損傷模型。

1.2.3 實驗分組 細胞分為4組：空白對照組、LPS組、miR-155過表達組（以下簡稱“過表達組”）和miR-155陰性對照組（以下簡稱“陰性對照組”）。細胞培養計數鋪板，PMA誘導48 h。不做任何處理的為空白對照組；LPS處理1.5 h為LPS組；miR-155模擬物處理36 h，再用LPS處理1.5 h為過表達組；miR-155模擬物的陰性對照處理36 h后用LPS處理1.5 h為陰性對照組。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測THP-1巨噬細胞中miR-155及IL-1β、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和NLRP3的表達 細胞按以上分組鋪板，每組設置3個復孔，轉染刺激以后，按照TRIzol試劑說明書提取總RNA；按說明書反轉錄制備cDNA，并用實時熒光定量PCR儀進行擴增，檢測miR-155以及IL-1β、TNF-α和NLRP3的表達。miR-155反應程序：95℃預變性15 min；富集低豐度目標miRNA：94℃20 s，65℃30 s，72℃34 s，5次循環；94℃變性20 s；60℃退火、延伸34 s；其中變性、退火延伸45次循環。IL-1β、TNF-α和NLRP3反應程序：95℃預變性30 s；95℃變性10 s；60℃退火30 s；其中變性、退火步驟40次循環。引物序列見表1。分別選擇u6和gapdh為內參基因，獲得Ct值后，用2-△△Ct法對目的基因進行定量計算。

表1 實時熒光定量PCR實驗引物序列

1.2.5酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測上清液中IL-1β和TNFα的分泌量 收集細胞上清液于EP管中，根據ELISA試劑盒說明書，分別檢測上清液中IL-1β和TNF-α的分泌量，用酶標儀測定450 nm處的吸光度（OD）值，根據標準曲線計算檢測物質的實際濃度。

1.2.6 蛋白質印跡法（Western blot，WB）分析蛋白表達THP-1細胞接種于6孔板，轉染刺激后，每孔加入RIPA裂解液，立即將6孔板水平放于冰上30 min，提取總蛋白進行超聲裂解，并于4℃、12 000 r/min離心10 min，吸取上清液，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書測定上清液中蛋白的濃度，將蛋白樣品與蛋白上樣緩沖液充分混勻，100℃金屬浴10 min使蛋白充分變性。蛋白樣品選取10% SDS-PAGE恒壓120 V電泳，250 mA電流下轉到PVDF膜上，封閉液（5%脫脂奶粉）封閉1 h，PBS緩沖液洗膜3次后加入相應一抗，放于4℃冰箱孵育。次日，PBST緩沖液洗膜后加入二抗孵育1 h，再洗膜3次，經ECL發光液顯色，化學發光成像系統曝光得到蛋白條帶，使用Image J軟件半定量分析條帶灰度值，將蛋白條帶導入軟件Image J轉化為灰度圖片，并消除圖片背景的影響，設置定量參數以及單位，將蛋白條帶轉換成亮帶，手動框選各個蛋白泳道測量得到灰度值，計算目的蛋白灰度值與GAPDH灰度值的比值，即可得到目的蛋白的相對表達量。

1.2.7 統計分析 實驗數據采用GraphPad Prism 6.0軟件進行處理，計量結果用（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LPS促進THP-1巨噬細胞中IL-1β、TNF-α、NLRP3以及miR-155的表達實時熒光定量PCR結果顯示，經LPS處理后，細胞中IL-1β、TNF-α和NLRP3在mRNA水平的表達升高，說明炎癥模型構建成功；同時，在LPS誘導的炎癥中，miR-155的表達上調。見圖1。

2.2 miR-155促進LPS誘導的THP-1巨噬細胞中IL-1β、TNF-α、NLRP3的表達實時熒光定量PCR結果顯示，miR-155模擬物處理細胞后，其表達顯著升高，證明轉染成功。見圖2A。此外，過表達miR-155，增強了LPS誘導的細胞中IL-1β、TNF-α、NLRP3的表達。見圖2B～D。

2.3 miR-155促進LPS誘導的THP-1巨噬細胞中IL-1β、TNF-α的蛋白表達量將收集的上清液用于ELISA實驗，結果顯示，經LPS刺激，細胞中IL-1β和TNF-α的分泌量增加。過表達miR-155，LPS刺激的IL-1β和TNF-α蛋白表達水平的升高更顯著。見圖3。

2.4 miR-155促進LPS誘導的THP-1巨噬細胞中NLRP3、Caspase-1蛋白的表達分別檢測NLRP3信號通路中NLRP3和Caspase-1蛋白的表達情況。結果顯示，LPS刺激后細胞中NLRP3和Caspase-1蛋白表達上升；過表達miR-155，LPS刺激的NLRP3和Caspase-1蛋白的表達水平顯著增加。見圖4。

3 討論

炎癥反應在機體疾病的發生發展中扮演著重要角色，多種炎癥細胞和炎癥因子參與該過程，其中巨噬細胞作為固有免疫的首道防線，表達甘露糖受體、清道夫受體、Toll樣受體、補體受體、細胞因子受體以及主要組織相容性復合體等多種表面標志物，具有識別并清除異物、促進炎癥反應、殺傷腫瘤和病毒感染細胞、提呈抗原和免疫調節等作用，在炎癥反應中處于核心地位。巨噬細胞被LPS刺激后，可極化為M1型巨噬細胞，產生和分泌IL-1β和TNF-α，導致炎癥損傷〔13-14〕。IL-1β和TNF-α是介導炎癥反應的重要炎癥因子，檢測IL-1β和TNF-α的含量可以得知細胞是否處于炎癥狀態，基于以上基礎，本研究參考Maess等〔5〕的方法，使用100 ng/mL PMA刺激THP-1細胞48 h，將其誘導分化為巨噬細胞，并用LPS刺激，結果發現，巨噬細胞中IL-1β和TNF-α表達顯著升高，說明成功構建炎癥損傷模型，并驗證了LPS具有促炎和誘導巨噬細胞極化的作用〔15〕。

據報道〔16〕，IL-1β是NLRP3炎癥小體的下游因子，NLRP3是一組廣泛存在于巨噬細胞、樹突狀細胞和其他一些免疫細胞中的多蛋白復合物，作為先天免疫的主要組成部分，NLRP3在正常情況下處于失活狀態，當細胞受到LPS刺激被損害時，NLRP3則被激活并呈遞信號，誘導IL-1β等炎癥因子釋放，啟動炎癥反應。NLRP3在多種常見的炎癥性疾病中發揮關鍵作用，在骨關節炎中，羥基磷灰石晶體能夠激活IL-1β并通過NLRP3炎癥小體促進其產生，從而介導炎癥和關節疾病〔17〕；在動脈粥樣硬化伴巨噬細胞浸潤的炎癥反應中，NLRP3炎癥小體被激活后，通過促進IL-1β釋放，最終導致動脈粥樣硬化的進展〔18〕。因此，NLRP3炎癥小體被認為是治療許多與炎癥相關疾病的有望靶點。同樣，本實驗檢測到IL-1β上調之后，繼續檢測NLRP3炎癥小體mRNA水平的表達，發現其表達也升高，這一結果與之前的報道一致〔6〕，并為后續的實驗提供了依據。

miRNA是一類非編碼小分子RNA，通過抑制mRNA翻譯或促進mRNA降解來調節基因轉錄后的表達水平〔19〕。目前研究〔20〕發現多種miRNA在炎癥性疾病中異常表達，并且通過調節信號通路影響炎癥因子和炎癥性蛋白的表達，從而參與炎癥反應的發生發展，其中NLRP3研究較為廣泛。例如：miR-21正向調節巨噬細胞中NLRP3炎癥小體的激活，促進IL-1β分泌和Caspase-1活化，最終促進LPS誘導的細胞焦亡和感染性休克；在腎臟炎癥中，miR-10可以靶向抑制NLRP3炎癥小體的組裝，抑制Caspase-1切割和IL-1β成熟，使促炎因子TNF-α和白細胞介素6的釋放減少，減輕細胞的損傷和凋亡〔21〕。由此可知，miRNA可通過調節NLRP3來影響炎癥的進展，故此，本研究旨在探索在THP-1巨噬細胞炎癥反應中，NLRP3的激活是否也受miRNA的調控。

在miRNA家族中，miR-155在多種激活的細胞中異常表達，與炎癥反應密切相關，據報道用LPS誘導人單核細胞，在miRNA基因表達譜中發現miR-155表達上調〔22-23〕，本實驗使用LPS刺激THP-1巨噬細胞后，發現miR-155表達上調，與上述實驗結果一致。此外，Fan等〔24〕研究表明，在骨關節炎中，miR-155通過靶向和抑制PIK3R1的表達調控PI3K/Akt通路，最終促進IL-1β誘導的體外軟骨細胞凋亡和分解代謝活性；在THP-1細胞中，過表達miR-155會抑制腫瘤抑制因子SHIP1的表達，進而激活Akt信號通路，導致腫瘤的發生〔25〕。由此可知，在炎癥反應中，miR-155可通過不同的機制發揮調控功能。本研究中，在LPS刺激構建的體外炎癥模型中過表達miR-155，發現THP-1巨噬細胞中炎癥因子IL-1β、TNF-α的表達顯著升高，NLRP3炎癥小體通路相關蛋白NLRP3和Caspase-1的表達也升高，由此可知，miR-155可以通過激活其潛在靶點NLRP3信號通路促進炎癥反應。

本研究初步探討發現miR-155可以激活NLRP3信號通路，促進LPS誘導的THP-1巨噬細胞中炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達，因此通過靶向抑制miR-155/NLRP3軸，可為治療炎癥性疾病提供新思路。