骨髓間充質干細胞靶向p16INK4a 蛋白誘導慢性髓細胞性白血病細胞K562衰老的分子機制

周 雯，唐紫云，何思悅，劉小虎，周 玥

（大理大學基礎醫學院，云南 大理 671000）

慢性髓細胞性白血病（chronic myeloigenous leukemia，CML）是一種骨髓增生性腫瘤，其特點是染色體9q34的ABL1基因與染色體22q11.2上的斷點簇區BCR基因的融合，這種重排被稱為費城染色體〔1〕。K562細胞是從人CML急性病患者中分離的細胞，費城染色體陽性，被用作為CML的細胞模型。化療是當前治療白血病的主要方法，大部分患者通過化療可達到臨床完全緩解的治療效果。酪氨酸激酶抑制劑的廣泛使用使患者總體生存時間提高到幾乎接近于普通人群的預期壽命〔2〕。但化療藥物在殺傷腫瘤細胞的同時對機體正常細胞也帶來不同程度的損傷〔3〕，使治療難以進行。因此，探尋CML有效、安全的治療方法成為人們關注的焦點。

正常的造血需要骨髓微環境和造血干細胞之間的雙向相互作用。白血病細胞破壞了造血干細胞的微環境，其腫瘤細胞將微環境的穩態轉變為有利于白血病細胞加速增殖的狀態。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSC）作為骨髓微環境的一員在白血病的發展和治療中發揮著不可或缺的作用〔4〕。據報道〔5-6〕，間充質干細胞可通過分泌細胞因子或阻滯細胞周期來抑制K562細胞的增殖能力。Fathi等〔7〕研究表明，間充質干細胞分泌的白細胞介素6、白細胞介素8和轉化生長因子-β可通過Wnt5α/β-Catenin和p53通路降低白血病細胞端粒酶活性和端粒長度。由此可見，間充質干細胞對白血病細胞的增殖具備調控作用，但具體機制尚不清楚。p16INK4a蛋白是常見的衰老調控分子，它的激活已被證明是最有用的體內衰老標志物之一〔8〕。p16INK4a蛋白的表達是高度動態的，在健康的年輕組織中基本不存在，但在許多老化的組織中被檢測到〔9〕。有報道〔10-11〕稱，將p16基因轉染至K562細胞后，K562細胞表面電荷密度增高，限制了K562細胞的增殖和遷移功能。提示p16基因的表達對K562細胞的功能起到一定的調控作用。本文旨在探究BMMSC能否通過誘導K562細胞衰老而抑制其增殖能力，同時探討p16INK4a蛋白在BMMSC誘導K562細胞衰老中的調控作用，為誘導白血病細胞衰老的途徑提供理論和實驗基礎。

1 材料

1.1 細胞及實驗動物K562細胞購于齊氏生物科技有限公司。6~8周SPF級C57BL/6J雄性小鼠，體質量20~30 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2019-0004。

1.2 主要試劑及儀器DMEM/F12培養基、青-鏈霉素（賽業生物科技有限責任公司，批號：69010395、BL505A）；RPMI-1640培養基（普諾賽生命科技有限公司，批號：PM150110）；胎牛血清（BI公司，批號：C04001050）；胰蛋白酶（Hyclone公司，批號：J190034）；骨髓間質干細胞成骨、成脂誘導分化培養基試劑盒（Cyagen公司，批號：MUBMX-90031、MUBMX-90021）；SA-β-Gal衰老染色試劑盒（碧云天生物技術公司，批號：C0602）；細胞周期檢測試劑盒（KeyGENBioTECH公司，批號：KGA512）；細胞裂解液、ECL化學發光試劑盒（Thermo Fisher公司，批號：FNN0011、WP20005）；PE-anti-human CD29、PE-anti-human CD44、PEanti-human CD45（Bioscience公司，批號：SC3746、SC7297、SC1178）；CDKN2A/p16INK4a、β-actin、HRP標記山羊抗兔IgG（abcam公司，批號：EPR1473、ab210083、ab97051）；PBS、TBST緩沖液（索萊寶生物科技有限公司，批號：P1020、T1081）；酶標儀（BIORAD公司）；流式細胞儀（CytoFLEX公司）。

2 方法

2.1 實驗分組取對數生長期K562細胞和第3~6代BMMSC進行實驗，分為對照組和實驗組，對照組僅含K562細胞；實驗組BMMSC和K562細胞比例分別為1∶4、1∶2、1∶1及2∶1，培養24、48、72 h，篩選出細胞最佳比例和作用時間后進行后續實驗。

2.2 骨髓來源間充質干細胞的分離與培養頸椎脫臼法處死小鼠，75%乙醇浸泡15 min，于超凈工作臺中剪斷雙足。剝離皮毛后緊貼脊柱平行剪斷股骨，避免破壞股骨腔完整性。分離出的腿骨暫置于含青-鏈霉素的PBS緩沖液中，漂洗3次，剪開脛、股骨兩端，用1 mL注射器吸取DMEM/F12完全培養基（DMEM/F12基礎培養基+10%胎牛血清+1%青-鏈霉素）沖出骨髓腔內容物，直至骨體發白。吹打均勻后收集細胞懸液，1 000 r/min離心5 min后收集小鼠骨髓細胞，每只小鼠的骨髓細胞放入2個6 cm培養皿，置于37℃、5% CO2細胞培養箱中培養。48 h后半量換液，以后每3 d換液，并用PBS緩沖液輕柔沖洗培養皿，待細胞生長融合至80%~90%時按1∶1或1∶2的比例進行傳代。

2.3 流式細胞術檢測BMMSC的表面標志物和K562細胞周期取第3代BMMSC，PBS緩沖液沖洗3次，胰蛋白酶消化后，用PBS緩沖液將其調整為1×106個/mL的細胞懸液，分別往4支1.5 mL EP管內加入100 μL細胞懸液，依次加入PE-anti-human CD29、PE-anti-human CD44、PE-anti-human CD45、PBS緩沖液各5 μL，室溫避光孵化30 min，1 000 r/min離心5 min，去除上清液，200 μL PBS緩沖液重懸，1 000 r/min離心5 min，上機檢測。

取對數生長期K562細胞2×105個/孔與各實驗組共培養48 h后，離心收集細胞，加入1 mL預冷的70%乙醇，4℃固定過夜。染色前細胞用PBS緩沖液洗滌2次，細胞重懸于含核糖核酸酶A的PBS緩沖液中，37℃孵育30 min消化RNA。加人PI染液，緩慢并充分重懸細胞沉淀，37℃避光溫浴30 min。染色完成后用流式細胞儀在488 nm激發波長、507 nm發射波長下檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況。

2.4 BMMSC的成脂誘導分化消化重懸后將4×104個第3代BMMSC接種在24孔板中，每孔加入0.5 mL DMEM/F12完全培養基。置于37℃、5% CO2培養箱中進行培養，每隔3 d更換DMEM/F12完全培養基，直到細胞融合度達到100%或者過融合。吸走完全培養基，向24孔板中加入0.5 mL配制好的成脂誘導分化培養基A液。誘導3 d后吸走A液，加入0.5 mL成脂誘導分化培養基B液。24 h后吸走B液，換回A液進行誘導。A液和B液交替作用3~5次（12~20 d），繼續用B液維持培養4~7 d直到脂滴變得足夠大、足夠圓。B液維持培養期間，每隔2~3 d需要換用新鮮的B液。成脂誘導分化結束后，使用油紅O染色，于顯微鏡下觀察成脂染色效果。

2.5 BMMSC的成骨誘導分化取第3代BMMSC，消化重懸后取2×104個BMMSC接種在事先包被0.1%明膠的24孔板中，每孔加入0.5 mL DMEM/F12完全培養基，置于37℃、5% CO2培養箱中進行培養，直到細胞融合度達到60%~70%時吸走完全培養基，換成0.5 mL配制好的成骨誘導分化完全培養基繼續培養，每隔3 d換液，誘導2~3周后，視細胞的形態變化及生長情況，用茜素紅進行染色，于顯微鏡下觀察成骨染色效果。

2.6 CCK-8法檢測細胞增殖能力取第3代BMMSC消化重懸后按與K562細胞的比例為1∶4、1∶2、1∶1、2∶1分別鋪入4個24孔板中，待細胞貼壁后移除DMEM/F12完全培養基，加入500 μL含1×105個K562細胞的RPMI-1640培養基，并設置僅含K562細胞的對照組和含RPMI-1640培養基的空白組分別培養24、48、72 h，輕柔吹打收集24孔板中的K562細胞鋪入96孔板中，每組5個復孔，每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于37℃、5% CO2培養箱內繼續培養4 h，用酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度（OD）值，并計算細胞增殖率。細胞增殖率（%）=[（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）]×100%。

2.7 SA-β-Gal染色法檢測K562細胞衰老情況取對數生長期K562細胞1×105個/孔與BMMSC共培養48 h，PBS緩沖液洗滌2次，固定液常溫固定15 min；再用PBS緩沖液離心洗滌3次，加入配制好的染色液置入37℃、無CO2的恒溫培養箱中過夜。12 h后置于顯微鏡下觀察，計算400個細胞中的陽性細胞率。

2.8 蛋白質印跡法檢測衰老調控分子p16INK4a的表達對數生長期K562細胞1×106個/孔與各實驗組共培養48 h后收集各組K562細胞，PBS緩沖液洗滌2次，提取各組細胞總蛋白，按BCA蛋白濃度測定試劑盒方法測定總蛋白濃度，取等量總蛋白經SDS-PAGE電泳分離后轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入兔抗鼠CDKN2A/p16INK4a一抗（1∶200），4℃過夜，TBST緩沖液漂洗2次；加入HRP標記的羊抗兔二抗（1∶5 000），室溫反應2 h，TBST緩沖液洗膜3次，ECL增強發光試劑顯色，凝膠成像系統曝光，顯影定影后觀察結果。

2.9 統計分析運用SPSS 26.0軟件進行數據分析，兩樣本間均數比較使用獨立樣本t檢驗，數據以（±s）表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 BMMSC的形態觀察原代BMMSC形態大小不一，呈圓形。2~3 d后可見部分細胞貼壁生長，呈多角形或橢圓形，散在分布。見圖1A。7 d后細胞變長呈紡錘形或梭形，呈漩渦狀。見圖1B。傳代后細胞增殖速度明顯變快，形成多個相互獨立的成纖維樣細胞。見圖1C。

3.2 BMMSC表面標志物的鑒定流式細胞儀檢測結果顯示，第3代BMMSC表面標志物CD29、CD44的陽性表達率分別為89.18%、87.65%；造血干細胞表面標志物CD45陽性表達率為1.16%。見圖2。

3.3 BMMSC的成脂、成骨分化加入成脂誘導液14 d時出現大量透光性良好的大小不等的空泡，排列不規則，油紅O染色可見紅色脂滴。見圖3A。加入成骨誘導細胞液后BMMSC開始變大，長紡錘形細胞數量減少，多角形細胞數量增加，形成大量小結節，誘導至第21天，茜素紅染色可見大量橘紅色鈣結節。見圖3B。

3.4 BMMSC對K562細胞增殖的影響與對照組相比，培養24、48、72 h后各實驗組K562細胞增殖率逐漸降低，在每個時間點，細胞比例為2∶1的組別K562細胞增殖率均最低。當細胞比例為2∶1時，共培養48、72 h的K562細胞增殖率均低于24 h時K562細胞的增殖率，48 h時K562細胞增殖率最低，差異有統計學意義（P＜0.05）。共培養48 h與72 h時K562細胞增殖率無明顯差異。見表1。故選擇BMMSC和K562細胞比例2∶1的實驗組，共培養時間為48 h進行后續實驗。

表1 BMMSC對K562細胞增殖率的影響（±s，n=3）

表1 BMMSC對K562細胞增殖率的影響（±s，n=3）

注：與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與培養24 h比較＃＃P＜0.01。

增殖率/%24 h 48 h 72 h對照組 — 100.000 100.000 100.000組別 細胞比例實驗組■■■■■■■■■■■■■1∶4 94.427±3.070 93.669±4.235 90.046±3.588*1∶2 92.651±2.112* 88.084±4.161* 90.898±1.749*1∶1 80.930±4.945* 78.944±8.156* 69.433±5.692**2∶1 75.134±3.550* 57.362±3.811**＃＃ 59.351±7.481**＃＃

3.5 BMMSC對K562細胞衰老的影響與BMMSC共培養48 h后，SA-β-Gal染色衰老陽性細胞呈藍色。見圖4。對照組K562細胞陽性率為（14.500±2.858）%，實驗組細胞陽性率為（41.750±5.683）%，與對照組相比，實驗組細胞陽性率明顯增高，差異有統計學意義（P<0.01）。

3.6 BMMSC對K562細胞周期的影響與BMMSC共培養48 h后K562細胞周期改變。見圖5、表2。與對照組相比，實驗組K562細胞阻滯在G0/G1期增多，進入S期和G2/M期的細胞減少。

表2 BMMSC對K562細胞周期的影響（±s，n=3）

表2 BMMSC對K562細胞周期的影響（±s，n=3）

注：與對照組比較**P＜0.01。

組別 G0/G1期/% S期/% G2/M期/%對照組 59.113±1.141 36.587±1.490 4.300±0.528實驗組 72.950±2.247** 23.247±1.811** 3.803±0.504

3.7 BMMSC對K562細胞p16INK4a蛋白表達量的影響與BMMSC共培養48 h后K562細胞的p16INK4a蛋白表達量為（42.703±1.520）kD，對照組p16INK4a蛋白表達量為（17.196±2.196）kD；與對照組相比，實驗組p16INK4a蛋白表達量明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01）。見圖6。

4 討論

骨髓微環境的動態演化參與了白血病細胞的增殖和浸潤。對急性髓性白血病的研究表明，骨髓微環境的正常化可減緩疾病進展，證實微環境是白血病患者的新治療靶點〔12〕。在骨髓微環境中輸注間充質干細胞減少了腫瘤負荷并延長了白血病小鼠的生存期〔13〕。這些證據都表明了BMMSC是白血病治療的一個可靠切入點。間充質干細胞是造血干細胞微環境中異于造血干細胞的一類具有自我更新、修復損傷，具有多向分化潛能的干細胞，能維持造血干細胞的自我更新、增殖分化、歸巢遷移等功能〔14〕。小鼠和人間充質干細胞上的細胞表面分子表達譜相似，來源于小鼠的BMMSC能夠在體外支持人類造血干細胞的增殖和遷移能力〔15〕，遂使用全骨髓貼法分離小鼠BMMSC與慢性粒細胞白血病K562細胞共培養，體外模擬白血病干細胞龕。

細胞增殖能力降低和SA-β-Gal活性增高是衰老的表現。本研究結果顯示，將BMMSC與K562細胞共培養后，能夠抑制K562細胞增殖。SA-β-Gal活性一直是使用最廣泛的衰老生物標志物，pH=6時，在經歷復制性或誘導性衰老的細胞中檢測到，但在增殖細胞中不存在〔16〕，被認為是衰老檢測的金標準。本研究BMMSC作用于K562細胞后，SAβ-Gal染色細胞陽性率增高，提示BMMSC可誘導K562細胞衰老。

哺乳動物細胞中的癌基因激活導致限制腫瘤生長的增殖應激和衰老誘導。因此，衰老是一種生理性的腫瘤抑制機制，可抑制良性腫瘤病變向惡性腫瘤發展。細胞衰老是指先前具有增殖能力細胞的一種特定形式的高度持久的細胞周期停滯，該細胞對有絲分裂刺激具有抗性，并伴有持續的DNA損傷反應〔17〕。細胞周期的進展取決于細胞通過4個細胞周期檢查點，即G1到S過渡、S期檢查點、G2到M過渡和有絲分裂紡錘體檢查點〔18〕。G1是一個許多信號介入影響細胞分裂和細胞發育程序部署的時期，進一步決定是否自我更新、分化或死亡〔19〕；細胞阻滯在G0/G1期后，失去分裂能力，對腫瘤的增長失去作用。p16INK4a屬于INK4基因家族，是常見的衰老相關基因，據報道〔20〕，從BubR1小鼠中去除表達p16INK4a基因的細胞，延緩了小鼠年齡相關疾病的進展。不僅如此，p16INK4a基因在細胞周期中還可以負向調節pRb-E2F通路。p16INK4a基因與CDK4/6結合抑制其激酶活性，從而阻止Rb磷酸化，將其維持在低磷酸化狀態，促進Rb與E2F1的結合并導致G1細胞周期停滯。因此p16INK4a不僅可以抑制細胞周期蛋白依賴性激酶，導致G1期停滯，還可以通過長期的高表達推動細胞進入衰老〔21〕。將INK4a基因轉染到具有INK4a基因缺陷的K562細胞中，p16INK4a基因誘導K562細胞周期停滯在G0/G1期，并促進活K562細胞的紅系分化，還能誘導分化不完全的K562細胞凋亡，提示p16INK4a基因能夠抑制K562細胞的功能，可以對K562細胞產生調控作用〔22〕。本研究中BMMSC使K562細胞的p16INK4a蛋白表達明顯升高，K562細胞在G0/G1期增多，進入S期和G2/M期的細胞減少。說明BMMSC可以通過上調p16INK4a蛋白的表達抑制K562細胞周期的進展，誘導K562細胞衰老，減少K562細胞的惡性增殖。K562細胞衰老是一個受多因素調節的過程，BMMSC誘導K562細胞衰老是否還有其他調控機制發揮作用有待進一步探討。該研究為后續體內實驗提供了理論基礎，為臨床白血病診療提供了新的靶點和思路。