水楊酸處理對番茄褪綠病毒抗性影響的初步研究

王宇，王輝，朱文瑩，李文麗，王富

(青島農業大學園藝學院，山東 青島 266109)

番茄(Solanum lycopersicumL)是世界上最重要的蔬菜作物之一。許多病原體能夠引起番茄病害，并阻礙其生產。由于缺乏有效的控制措施，病毒病成為許多地區番茄生產的主要限制因素[1]。

番茄褪綠病毒(Tomato chlorosis virus，ToCV)隸屬長線形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒屬(Criniviru)，最早于20世紀90年代中期在美國發現[2]。ToCV不能通過種子、汁液摩擦、機械摩擦傳播，只能通過煙粉虱以半持久性方式傳播[3]。ToCV侵染番茄植株后潛伏期較長，通常在感染后3～4周才引起癥狀[4]。感染ToCV的植株一般從中下部葉片出現癥狀并逐漸向上發展，中部葉片表現為葉脈間輕微褪綠黃化，底部葉片則出現明顯的褪綠黃化，葉脈深綠，感病葉片變脆且易折，葉片黃化疑似營養缺素癥[5]。盡管該病毒在果實上沒有明顯的癥狀，但由于光合面積的損失，產量顯著降低[6]。

水楊酸(salicylic acid，SA)是一種化學誘導因子，也是系統獲得性抗性(SAR)信號轉導通路中重要的信號分子，在植物中作為導致SAR誘導信號轉導途徑的關鍵組成部分發揮作用，并在抵抗包括真菌、細菌和病毒在內的所有微生物病原體方面也發揮作用[7]。SA因具有高效、無毒、對環境無害、使用方法簡單和成本低廉等優點而成為一種新型的抗病性誘導劑[8]。外源SA處理可以誘導黃瓜、辣椒、番茄等多種植物產生局部和系統抗性[9－14]。然而，SA對番茄褪綠病毒病危害是否有緩解作用，目前國內外尚未見報道。本研究以番茄褪綠病毒病易感品種‘Moneymaker’為試驗材料，對番茄幼苗葉片噴施SA和接種ToCV處理，并對接種4周內各處理番茄植株病情指數、帶毒量、抗氧化酶活性、抗逆應激相關基因表達量及光合參數等進行檢測，進而探明SA對番茄褪綠病毒病的抑制作用，從而為該病害的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與生長條件

供試材料:易感番茄褪綠病毒病番茄品種‘Moneymaker’。

植物生長條件:選擇飽滿種子置于放有濕潤濾紙的培養皿上，28℃人工氣候箱(RXZ智能型，寧波江南儀器廠生產)黑暗催芽3 d。出芽后播種于育苗穴盤，人工氣候室中(光/暗:2h/12h；溫度:25℃/16℃；濕度設置為75%)培養至4片真葉并移栽于直徑10 cm的花盆中。

1.2 水楊酸處理和番茄褪綠病毒接種

水楊酸處理方法:用無菌水配置2 mmol/L SA水溶液，當番茄生長至5～6片真葉時平均分成兩份，其中一份噴施2 mmol/L SA水溶液至葉面均勻分布，另一份噴施等體積的無菌水，每隔1 d噴施1次，共噴施3次，之后進行病毒接種。

病毒接種方法:取飼養的健康煙粉虱用帶ToCV的番茄葉片喂養48 h以獲得攜帶ToCV的煙粉虱，經隨機取樣檢測確認帶毒后，用微蟲籠轉移帶毒煙粉虱至噴施完SA或無菌水的番茄植株第4片真葉上，每株番茄接種25頭，取食48 h后移除煙粉虱。噴施無菌水和SA的番茄幼苗各隨機取一半植株進行帶毒煙粉虱接種處理。共設置噴施無菌水(W)、噴施無菌水后接種病毒(W＋ToCV)、噴施水楊酸(SA)和噴施水楊酸后接種病毒(SA＋ToCV)4個處理。每個處理25～30株番茄植株，重復3次。分別于移除煙粉虱后7、14、21、28 d取相同部位番茄葉片，立即冷凍在液氮中，－80℃保存。

1.3 病情指數計算

番茄褪綠病毒病的分級方法如下。其中，0級:番茄植株沒有癥狀；1級:番茄植株下部僅有部分葉片出現葉脈間褪綠黃化，葉片變脆變厚；2級:植株從下部開始有一半葉片出現葉脈間褪綠黃化，葉片變脆變厚；3級:植株大面積葉片出現葉脈間褪綠黃化，葉片變脆變厚；4級:植株整株出現癥狀，褪綠黃化非常嚴重，基本沒有健康組織。病情指數(DI)計算公式如下:

病情指數＝∑(各級發病植株數×各級別代表值)/(調查總植株數×最高級別代表值)×100 。

1.4 番茄樣品ToCV病毒量及應激相關基因表達量檢測

葉片總RNA的提取采用艾科瑞生物公司的SteadyPure植物RNA提取試劑盒進行。cDNA的合成采用Vazyme公司的HiScript III All－in－one RT SuperMix Perfect for qPCR試劑盒進行。參照丁天波等[15]的方法，通過qRT－PCR進行病毒檢測，所用引物ToCVqF:5′－CTTTCTGGATGGTTTGCGGC－3′；ToCVqR:5′－TCCCCAACCAATGGTCGTTT－3′。根據擴增曲線、熔解曲線和Ct值確定其帶毒情況，并根據標準曲線計算病毒感染量。

熒光定量所用引物如表1所示，以α－tubulin內參基因進行歸一化處理，基因相對表達量按照2－△△Ct法進行計算。熒光定量反應體系(20 μL):cDNA 2 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，TB GreenPremix Ex TaqⅡ10 μL，ddH2O 6 μL。LightCycler 480熒光定量儀程序:95℃預變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環。每個樣品3次生物學重復，3次技術重復。

表1 用于qRT－PCR的引物序列

1.5 抗氧化酶活性檢測

粗酶液的提取:稱取0.1 g番茄葉片，加入1 mL提取液，冰浴勻漿，8000 r/min、4℃離心10 min，取上清液，置冰上待測。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性分別采用對應檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)進行，測定波長分別為560、470、240 nm。

1.6 光合生理指標測定

使用便攜式光合測定儀(CIRAS－3型，美國PP Systems)，在同一時間測定植株節位一致的完全展開葉片的凈光合速率(Pn)、胞間CO2濃度(Ci)、氣孔導度(Gs)。每片葉重復3次取平均值。

1.7 數據分析

所有數據用Microsoft Excel 2016進行處理，DPS進行方差分析，GraphPad Prism 8作圖。

2 結果與分析

2.1 水楊酸處理對接種ToCV番茄幼苗病情指數及帶毒量的影響

接種病毒后7 d，W＋ToCV和SA＋ToCV處理均無植株出現褪綠癥狀；隨著接種時間的延長，W＋ToCV和SA＋ToCV處理植株的病情指數逐漸增加(圖1)，分別由接種后14 d的22.5%和7.5%增加到28 d的50.0%和37.5%，且兩處理間均差異顯著；接種后28 d，W和SA處理番茄植株葉色較為濃綠，且均正常坐果，而W＋ToCV和SA＋ToCV處理葉色褪綠較為明顯，并且W＋ToCV處理植株坐果受到較大影響，但SA＋ToCV處理褪綠癥狀較W＋ToCV處理有所緩解(圖2)。說明SA處理顯著減輕了番茄褪綠病毒的危害。

圖1 W＋ToCV和SA＋ToCV處理植株的病情指數

圖2 處理28 d后番茄植株的表型

由圖3可知，番茄葉片帶毒量隨接種天數的增加呈上升趨勢，接種后14 d與接種后7 d相比增幅較小，接種后21 d增幅較大，特別是接種后28 d帶毒量與接種后21 d相比高10～20倍。兩處理在接種后7、14、21、28 d帶毒量均存在顯著差異，說明SA處理顯著降低了接種ToCV后番茄植株的帶毒量。

圖3 W＋ToCV和SA＋ToCV處理番茄植株中ToCV病毒含量

2.2 水楊酸處理對接種ToCV后番茄葉片抗氧化系統的影響

抗氧化酶活性檢測結果(圖4)顯示，在接種病毒后7～21 d，各處理SOD活性均呈先下降后上升的趨勢，其中W＋ToCV和SA＋ToCV處理增幅較大，且W＋ToCV增幅較SA＋ToCV更大。各處理植株葉片的POD活性整體呈上升趨勢，除W處理外的各處理POD活性在接種病毒后21 d時最高。隨著接種時間的延長，各處理番茄植株葉片CAT活性呈逐漸下降趨勢。

圖4 各處理下番茄葉片抗氧化酶活性

2.3 水楊酸處理對接種ToCV后番茄葉片中應激相關基因表達量的影響

由圖5可知，W＋ToCV和SA＋ToCV處理Sl-PR1和SlPR2基因的表達均呈現先升高后降低趨勢，且均于接種病毒后14 d達到最大值。除第14 d，SA＋ToCV處理植株葉片中SlPR1轉錄水平均顯著高于W＋ToCV處理。W＋ToCV處理中SlPR5的表達模式與SlPR1和SlPR2的表達模式較為相似，但是表達量峰值延遲到接種病毒后21 d出現。

接種病毒后7 d，SA和SA＋ToCV處理番茄植株葉片中SlSOD、SlPOD及SlCAT2均被顯著誘導(圖5)，同時，W＋ToCV處理也顯著誘導了SlSOD的表達。接種病毒后14 d，SA處理中SlPOD和SlCAT2相對表達量較高，SA＋ToCV處理中SlSOD和SlPOD的相對表達量顯著高于其他處理。接種病毒后28 d，各處理間SlSOD、SlPOD及SlCAT2的相對表達量均無顯著差異。

圖5 各處理番茄葉片中抗逆應激相關基因的表達

2.4 水楊酸處理對接種ToCV后番茄葉片葉綠素含量及光合作用的影響

接種病毒后28 d，W、SA和SA＋ToCV處理葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量均顯著高于W＋ToCV處理，且W、SA和SA＋ToCV三處理葉綠素含量差異不顯著(表2)。光合生理指標測定結果顯示，W＋ToCV和SA＋ToCV處理的番茄植株葉片凈光合速率(Pn)差異不顯著，但均顯著低于W和SA處理，且SA處理顯著低于W處理。W＋ToCV處理番茄植株葉片蒸騰速率(Gs)顯著低于W處理，但與SA和SA＋ToCV間均無顯著差異。各處理胞間CO2濃度(Ci)無顯著差異。

表2 水楊酸處理對接種病毒后番茄植株葉片葉綠素含量及光合生理指標的影響

3 討論與結論

SA不僅能使植物產生系統獲得性抗性(SAR)和過敏反應(HR)，而且在病原體侵染植物后，還能活化一系列防衛反應信號傳遞過程中的重要成分[16]。在本研究中，外源SA顯著降低了接種ToCV后番茄植株的病情指數和葉片中的帶毒量，并且顯著減輕了番茄褪綠病毒的危害。SA處理的植物中疾病發生率較低的原因可能是由于SA在宿主－病毒相互作用中起著關鍵作用。有研究表明，SA處理增強了植物的抗病毒能力或由于SAR延遲了疾病癥狀的出現[17，18]。Bayram ?evik等[19]研究認為，大部分ToCV抑制基因與代謝、光合作用、防御和應激反應有關，ToCV感染直接減慢新陳代謝，對光合作用和植物防御產生不利影響。番茄植株感染ToCV后，葉片褪綠變黃，影響光合作用。本研究通過測定光合生理指標和葉片葉綠素含量證實ToCV顯著降低葉片葉綠素含量和凈光合速率，而SA處理后減輕ToCV對番茄葉綠素的破壞，也提高光合速率和蒸騰速率。

病毒感染促進細胞代謝，增加ROS的產生，從而破壞細胞室。在感染早期，H2O2含量的增加伴隨著抗氧化劑活性的降低，從而限制了病原體的生長和傳播，然后經歷程序性細胞死亡(PCD)的細胞會產生激活相鄰細胞防御反應的信號。其中SA及其衍生物就是參與植物防御反應放大的信號分子[20]。在NahG轉基因植物中，SA降解酶水楊酸羥化酶可降低SA的產生，導致轉基因植物更易受到病原微生物侵染[21]。SOD是第一個參與清除ROS過程的抗氧化酶，其主要作用是將超氧離子快速歧化為H2O2和分子氧。POD可通過催化與H2O2相關的各種氧化還原反應生成H2O，從而降低植物內部的氧化狀態[22]。外源噴施SA后，植物體內的SA水平提高，SA與SA受體蛋白結合，抑制POD的活性以及自由基的產生，激活POD的合成及其他防衛反應[23]。在番茄受到番茄黃化曲葉病毒侵染后，SOD活性和POD活性均有所提高[14]。本研究發現，接種ToCV處理后CAT活性下降，而POD活性逐漸升高。這表明番茄清除H2O2可能與POD活性的增加有關，而CAT活性的降低導致作為局部獲得性抗性(LAR)中的第二信使的H2O2含量增加[24]。

PRs的誘導被認為是抗性誘導的一個標志[25]。PRs是植物中具有潛在抗性的化合物，可以抵抗病原菌的入侵[26]。本研究表明，W＋ToCV和SA＋ToCV處理均能誘導SlPR1、SlPR2和Sl-PR5的表達。此外，本試驗還研究了ToCV和SA處理下活性氧清除酶基因的表達模式，ToCV和SA處理均誘導SlSOD、SlPOD和SlCAT2的表達，該結果與Li等[14]在研究SA誘導番茄抵御番茄黃化曲葉病毒抗性研究中的結果較為類似。前人研究發現，調控番茄防御反應可能是通過調控ROS清除酶和PRs基因的表達來實現，從而調控ROS和SA信號通路[27]。本研究結果也表明可能通過類似途徑增強了外源水楊酸處理對番茄褪綠病毒的抗性。