超聲輔助低共熔溶劑提取柴胡皂苷工藝及其抗氧化活性研究

譚天宇馮軍軍景正義賀鋒張帆杜鵬飛王守經(jīng)王靜李騰飛

(1.河北工程大學生命科學與食品工程學院/邯鄲市天然產(chǎn)物與功能食品開發(fā)重點實驗室，河北 邯鄲 056038；2.山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工與營養(yǎng)研究所/山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部新食品資源加工重點實驗室，山東 濟南 250100；3.河北工程大學材料科學與工程學院，河北 邯鄲 056038)

柴胡為傘形科植物柴胡(Bupleurum chinenseDC.)或狹葉柴胡(Bupleurum scorzonerifoliumWilld.)的干燥根，別名地熏、山菜、柴草等，味辛、苦，性微寒[1]。柴胡皂苷為柴胡中的有效成分，在藥典中規(guī)定柴胡中所含柴胡皂苷a(saikosaponin a，SSa)和柴胡皂苷d(saikosaponin d，SSd)的總量不得少于0.30%，并以兩者為指標控制柴胡品質(zhì)[2]。柴胡皂苷具有抗腫瘤、抗炎、抗癲癇和護肝等功效[3]。柴胡皂苷傳統(tǒng)提取方法有乙醇加熱回流法[4]、水提法[5]、超臨界提取法[6]等，存在提取率低、設備成本高、提取時間長及水溶性雜質(zhì)干擾等問題。因此有必要尋找一種綠色、高效的新型溶劑替代傳統(tǒng)溶劑，突破當前柴胡皂苷提取的技術(shù)瓶頸。

低共熔溶劑(deep eutectic solvents，DESs)作為一種代替有機溶劑和離子液體的新型溶劑，由Abbott等[7]在2003年首次合成。DESs被定義為至少由兩個組分組成的混合物，其中一個組分起氫鍵受體(HBA)的作用，另一個組分起氫鍵供體(HBD)的作用[8]。混合物的各組分能夠通過氫鍵相互作用，形成新的共晶相，其特征是沸點低于每一組分的沸點[9]。低共熔溶劑具有制備簡單、價格低廉、低揮發(fā)性、環(huán)境友好等優(yōu)點，近年來被廣泛用于食品及中藥活性成分提取、分離[10，11]。Fan等[12]采用疏水性天然醇的DES對奎寧進行提取，DES表現(xiàn)出很高的提取能力，萃取后的DES相可以重復使用，可用1.0%乙酸水溶液作為萃取溶劑，通過反萃取從DES相中回收奎寧；Mankar等[13]用氯化膽堿(ChCl)－羧酸基DESs在微波照射下從椰殼中提取木質(zhì)素，在合成的DESs中，ChCl∶乳酸(1∶4)的木質(zhì)素產(chǎn)率最高，為82%，純度>95%；Chen等[14]使用超聲協(xié)同天然低共熔溶劑提取芒果皮果膠，與HCl提取的果膠相比，兩種DES提取的果膠產(chǎn)率、分子量和粒徑顯著提高。當前，低共熔溶劑在天然產(chǎn)物活性成分提取方面顯示了巨大的優(yōu)勢和潛力，因此將其拓展應用于皂苷類成分的提取值得進一步研究。

為尋求柴胡皂苷綠色高效提取工藝，本研究采用超聲輔助－DES法，通過低共熔溶劑篩選以及單因素試驗、響應面設計試驗探究柴胡皂苷的最佳提取工藝，實現(xiàn)對柴胡皂苷的高效提取，同時對比不同提取方法得到的柴胡皂苷抗氧化活性，為后續(xù)柴胡原料品質(zhì)評價提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器設備

柴胡藥材，產(chǎn)自甘肅，購于藥材市場，經(jīng)邯鄲學院焦云紅副教授鑒定為北柴胡的干燥根。

柴胡皂苷d標準品(HPLC≥98%)，上海源葉生物科技有限公司；對二甲氨基苯甲醛、氯化膽堿、乙二醇、木糖醇、蘋果酸、乳酸、尿素、無水乙醇、磷酸，分析純；甲醇，色譜純；D101大孔吸附樹脂，天津百倫斯生物技術(shù)有限公司；1，1－二苯基－2－三硝基苯肼、2，2－二氮－雙(3－乙基苯并噻唑－6－磺酸)，合肥巴斯夫生物科技有限公司。

JA5003電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；FW100高速粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；SP200－2T智能磁力加熱攪拌器，杭州米歐儀器有限公司；UV－2700紫外可見分光光度計，島津儀器(蘇州)有限公司；SB25－12DTD超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；C－ARE旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海舍巖儀器有限公司；TG16高速離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；NDJ－8S旋轉(zhuǎn)粘度計，上海昌吉地質(zhì)儀器有限公司；傅里葉紅外光譜儀，天津港東科技股份有限公司；DZF－6050真空干燥箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 DES的制備 采用加熱攪拌法制備DES[7]。選用氯化膽堿作為氫鍵受體，分別與乙二醇、木糖醇、蘋果酸、乳酸、尿素5種氫鍵供體按一定的摩爾比混合(表1)，加入一定量去離子水，80℃磁力攪拌直至溶液澄清，冷卻至室溫，備用。

表1 低共熔溶劑種類及配比

1.2.2 DES表征 粘度:將制備好的5種低共熔溶劑在采用1號轉(zhuǎn)子、30 r/min條件下，使用旋轉(zhuǎn)粘度計進行粘度測定。

傅里葉紅外光譜分析(FTIR)[15]:將乳酸、氯化膽堿和DES－4(乳酸∶氯化膽堿＝2∶1)三個樣品置于真空干燥箱中，70℃干燥24 h除去所有水分，用于FTIR分析。

1.2.3 柴胡皂苷提取液的制備 將柴胡粉碎過80目篩，精確稱取柴胡粉末2 g，在料液比1∶40(g/mL)、80℃磁力攪拌120 min、超聲15 min條件下分別用5種低共熔溶劑提取柴胡皂苷，8000 r/min離心10 min，吸取上層清液，抽濾過0.45 μm濾膜，得到柴胡皂苷提取液。

1.2.4 柴胡皂苷含量的測定 標準曲線的繪制:精確稱取柴胡皂苷d標準品10.0 mg，甲醇定容至5 mL容量瓶內(nèi)。準確移取2 mg/mL柴胡皂苷d標準溶液0.05、0.25、0.50、0.75、1.00 mL于1 mL容量瓶，甲醇定容至刻度，配制成0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的柴胡皂苷d標準溶液。采用對二甲氨基苯甲醛乙醇溶液－磷酸顯色[16]，在545 nm處測定吸光值。標準曲線見圖1。

圖1 柴胡皂苷d標準曲線

樣品中柴胡皂苷提取量測定:取100 μL柴胡皂苷提取液并稀釋至標準曲線濃度范圍內(nèi)，按上述方法進行顯色反應，根據(jù)下式計算提取量。

式中:C為回歸方程計算得到的柴胡皂苷d濃度，mg/mL；V為上清液體積，mL；D為稀釋倍數(shù)；M為原材料的質(zhì)量，g。

1.2.5 超聲輔助DES－4提取柴胡皂苷的單因素試驗 設置低共熔溶劑體系摩爾比(乳酸∶氯化膽堿＝1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1)、料液比(1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 g/mL)、溶劑體系含 水量(0、10%、20%、30%、40%)、超聲時間(10、15、20、25、30 min)、超聲功率(60、150、240、330、420 W)5個因素，探究其對柴胡皂苷提取量的影響。

1.2.6 響應曲面法優(yōu)化柴胡皂苷提取工藝 采用Box－Behnken(BB)3因素試驗設計(表2)，對柴胡皂苷提取工藝進行優(yōu)化，確定低共熔溶劑摩爾比(A)、含水量(B)和超聲時間(C)對提取量(R)的綜合影響。

表2 響應面試驗分析因素水平

1.2.7 不同溶劑柴胡皂苷提取效果對比 在相同條件下，用水、70%乙醇[17]與DES同時提取柴胡皂苷，計算柴胡皂苷提取量。

1.2.8 抗氧化活性測定 取不同方法所得柴胡皂苷提取液凍干，配成0.1～0.5 mg/mL樣品溶液，進行DPPH·、ABTS＋自由基清除試驗[18]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Origin 2018作圖、Design－Expert V8.0.6進行響應面分析，SPSS 20.0進行顯著性分析。本試驗每個樣品重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 低共熔溶劑的篩選

DES主要通過與目標物形成分子間氫鍵增加其溶解度。本研究的5種DES均能與皂苷化合物形成分子間氫鍵，DES－1、DES－2含有大量羥基，DES－3、DES－4含有大量羧基，DES－5含有氨基[19]。如圖2所示，5種低共熔溶劑中DES－4即乳酸－氯化膽堿溶劑提取效果最好，柴胡皂苷提取量為12.38±0.49 mg/g，因此采用DES－4進行柴胡皂苷的提取和進一步優(yōu)化。

圖2 DES類型對柴胡皂苷提取量的影響

2.2 低共熔溶劑表征

2.2.1 粘度 DES由配位的氫鍵離子和分子組成，具有很強的水相容性和吸濕性[20]。粘度大降低DESs流動性，不利于提取。加水可以降低溶劑粘度。表3表明隨著溫度升高DES溶劑粘度降低。

表3 DESs粘度

2.2.2 傅里葉紅外光譜分析 如圖3所示，氯化膽堿O－H特征峰在3253 cm－1處，3367 cm－1為乳酸O－H特征峰。而在形成DES－4后，氯化膽堿和乳酸的O－H特征峰移動到3403 cm－1，氫鍵位置發(fā)生了藍移，證明乳酸和氯化膽堿通過氫鍵作用結(jié)合[21]。

圖3 DES－4傅里葉紅外光譜圖

2.3 單因素試驗結(jié)果分析

2.3.1 DES－4組分摩爾比對柴胡皂苷提取量的影響 低共熔溶劑組分比例變化會影響粘度、極性、表面張力等物理化學性質(zhì)，進而影響柴胡皂苷提取量。如圖4所示，隨著乳酸比例的增加，柴胡皂苷提取量增大，當乳酸－氯化膽堿摩爾比為2∶1時，提取量達到最大值。主要原因是乳酸比例的增加有效調(diào)節(jié)了乳酸－氯化膽堿體系的粘度，促進了柴胡皂苷的擴散，改善提取效率；但乳酸比例過大會減弱目標物質(zhì)與低共熔溶劑的相互作用。最終選擇乳酸－氯化膽堿摩爾比為2∶1進行后續(xù)試驗。

圖4 DES－4組分摩爾比對柴胡皂苷提取量的影響

2.3.2 料液比對柴胡皂苷提取量的影響 如圖5所示，料液比(g/mL)在1∶30到1∶40柴胡皂苷提取量呈上升趨勢，1∶40時提取量最大，為15.36 mg/g，1∶50到1∶70無顯著差異(P>0.05)。溶劑體積增大增加了柴胡皂苷與DES－4的接觸面積，促進溶質(zhì)與溶劑的結(jié)合；當溶劑體積過大，溶解度趨于平衡。本試驗選擇料液比1∶40 g/mL進行后續(xù)試驗。

圖5 料液比對柴胡皂苷提取量的影響

2.3.3 DES含水量對柴胡皂苷提取量的影響 圖6所示，柴胡皂苷提取量隨DES含水量加大呈先升后降變化，含水量20%時提取量達最大值，為15.09 mg/g。這是由于水的添加降低了低共熔溶劑體系粘度、增強體系極性；但水的比例過大會破壞低共熔溶劑體系中的氫鍵結(jié)構(gòu)[17]，同時降低低共熔溶劑與目標成分之間的相互作用。因此，選擇DES含水量20%進行后續(xù)試驗。

圖6 DES－4含水量對柴胡皂苷提取量的影響

2.3.4 超聲時間對柴胡皂苷提取量的影響 如圖7所示，超聲時間為10～20 min時柴胡皂苷提取量呈上升趨勢，這是由于超聲時間越長，超聲波充分作用于柴胡粉末，破壞細胞壁，使柴胡皂苷溶出；20 min時柴胡皂苷提取量最高，為14.39 mg/g，之后有所下降。因此選擇超聲時間20 min進行后續(xù)試驗。

圖7 超聲時間對柴胡皂苷提取量的影響

2.3.5 超聲功率對柴胡皂苷提取量的影響 如圖8所示，提取量隨著超聲功率的增大先升后降，超聲功率330 W時提取量達到最大，為15.32 mg/g。因為超聲波會促進柴胡皂苷在溶劑體系中的擴散，使柴胡與溶劑充分反應，而功率過高，可能會對柴胡皂苷結(jié)構(gòu)造成破壞，使提取率下降，導致提取量降低。因此，超聲功率選擇330 W。

圖8 超聲功率對柴胡皂苷提取量的影響

2.4 響應面試驗結(jié)果與分析

2.4.1 BB試驗結(jié)果及方差分析 基于單因素試驗結(jié)果設計三因素三水平響應面試驗，選擇A摩爾比、B含水量、C超聲時間三個因素為自變量，以R皂苷提取量作為響應值，采用中心復合試驗設計(表4)，旨在實現(xiàn)皂苷最高提取量。對17組數(shù)據(jù)進行多元擬合回歸分析，得到柴胡皂苷提取量擬合方程:

表4 試驗設計與結(jié)果

提取量(R)＝15.96－0.072A＋0.75B－0.047C＋0.20AB－0.58AC－0.086BC－1.19A2－1.28B2－0.73C2

方差分析結(jié)果(表5)顯示，工藝條件對提取量影響大小為B>C>A，即含水量>超聲時間>摩爾比。模型決定系數(shù)R2＝0.9831，表示模型具有較高的顯著性，而＝0.9614，證實模型可解釋實驗96.14%的響應值變化，說明構(gòu)建的響應模型合理，與真實數(shù)據(jù)貼合，可以用于分析柴胡皂苷提取量最優(yōu)工藝。

表5 提取量R方差分析

2.4.2 響應面交互分析與結(jié)果優(yōu)化 從圖9可以看出，摩爾比和含水量交互作用對提取量的影響呈拋物面，當其中一個因素不變時，提取量隨另一因素增加先上升后下降。相較而言，含水量對提取量影響更顯著，引起曲面較大幅度波動。摩爾比2∶1、溶劑體系含水量20%～25%是兩者交互下的最優(yōu)提取工藝組合。

圖9 摩爾比和含水量交互作用對柴胡皂苷提取量影響的等高線(a)和響應曲面(b)

圖10 所示摩爾比和超聲時間兩因素交互作用中，等高線圖呈橢圓形，表明兩因素交互對提取量影響顯著。提取量隨摩爾比和超聲時間的增加均呈現(xiàn)先增后減變化，取適中水平即摩爾比2∶1、超聲時間17～21 min時，柴胡皂苷提取量較大。

圖10 摩爾比和超聲時間交互作用對柴胡皂苷提取量影響的等高線(a)和響應曲面(b)

圖11顯示含水量為敏感影響因子，引起曲面波動較大，當含水量取20%～25%水平、超聲時間取17～21 min時，提取量較高。

圖11 含水量和超聲時間交互作用對柴胡皂苷提取量影響的等高線(a)和響應曲面(b)

2.4.3 驗證試驗 在單因素試驗確定料液比1∶40(g/mL)、超聲功率330 W基礎上，經(jīng)響應面優(yōu)化確定提取柴胡皂苷最優(yōu)工藝為:乳酸∶氯化膽堿(moL/moL)＝1.91∶1、含水量22.00%、超聲時間17.78 min，在此條件下預測的皂苷最大提取量為16.13 mg/g。為了驗證模型預測的準確性，結(jié)合實際操作，以溶劑摩爾比2∶1、含水量22%、超聲時間18 min為條件進行3次平行試驗，柴胡皂苷平均提取量為16.25 mg/g，與模型預估結(jié)果接近，表明該模型可用于優(yōu)化柴胡皂苷提取工藝。

2.5 不同提取方法效果比較

選擇水提法和乙醇提取法對比DES的柴胡皂苷提取效果。圖12顯示，超聲輔助DES－4(乳酸∶氯化膽堿＝2∶1)的柴胡皂苷提取量顯著高于水提法和乙醇提取法。

圖12 不同提取方法對柴胡皂苷提取量的影響

2.6 不同方法提取的柴胡皂苷抗氧化活性

圖13顯示，VC在0.1～0.5 mg/mL濃度范圍內(nèi)均表現(xiàn)出較高的自由基清除能力。不同方法得到的柴胡皂苷提取物對DPPH·和ABTS＋自由基均表現(xiàn)出一定清除能力，且隨濃度升高而增強。其中，柴胡皂苷水提物、乙醇提取物、DES提取物清除DPPH·的IC50值分別為0.40、0.32、0.22 mg/mL，清除ABTS＋自由基的IC50值分別為0.30、0.27、0.16 mg/mL。

圖13 不同方法提取的柴胡皂苷清除DPPH·(A)和ABTS＋(B)自由基的能力

3 結(jié)論

本研究建立了一種基于低共熔溶劑超聲輔助的柴胡皂苷綠色高效提取方法。采用單因素、響應面設計優(yōu)化提取工藝，確定最佳提取工藝為含22%水的乳酸－氯化膽堿(摩爾比2∶1)、料液比1∶40(g/mL)、超聲時間18 min、超聲功率330 W，在此條件下柴胡皂苷提取量為16.25±0.42 mg/g，顯著高于水提法(5.84±0.33 mg/g)和乙醇提取法(8.06±0.16 mg/g)。超聲輔助－DESs柴胡皂苷提取物清除DPPH·和ABTS＋自由基的IC50值分別為0.22、0.16 mg/mL，抗氧化能力高于水提物和乙醇提取物。采用DES對柴胡皂苷進行提取，工藝流程操作簡便，工藝優(yōu)化后柴胡皂苷得率較好。DESs的優(yōu)異性能顯示了其作為提取天然產(chǎn)物中生物活性物質(zhì)溶劑的潛力。