香樟葉浸提物對銅綠微囊藻的抑制研究

王 玲，吳曉青，單 龍

(江蘇省鹽城環境監測中心，江蘇 鹽城 224000)

1 引言

樟樹系樟樹屬的常綠喬木植物,是我國亞熱帶綠闊葉林的主要樹種之一，資源豐富。樟樹具有驅蟲、防腐、耐蛀的特點，可提取樟樹葉色素、香料等用來制成植物農藥、氧化劑和醫藥產品等[1～3]。樟樹葉為可再生資源,其應用前景廣闊，其含有的黃酮類化合物具有抗過敏、降血壓、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗病毒、保肝和降血脂等活性[4，5]。在食品學和醫學中均已得到廣泛應用，在食品工業上可作抗氧化劑、色素和甜味劑等[6],在醫學上對治療冠心病、腦血栓和消除自由基等方面有顯著效果[7]。目前，國內外相關研究大多僅針對樟樹葉中精油的提純和利用[8]，而對于其黃酮的提取及含量測定研究甚少。本文采用乙醇提取法提取樟樹葉中的黃銅類化合物，并對對每個影響因素進行了分析，采用正交實驗確定了最佳提取方案。同時采用硝酸鋁比色法測定了香樟葉中黃酮的含量。

微囊藻是一類全球性分布的藍藻，在我國大部分富營養化的水體中，銅綠微囊藻在數量和發生頻率上都占有優勢[9，10]。銅綠微囊藻為多細胞的群體,細胞呈淺藍色、亮綠色或橄欖綠色,大多生長在湖泊池塘等有機質豐富的水體中,營浮游生活。當條件適合時,常會暴發大規模的水華[11]，并且在藻細胞死亡或細胞膜通透性增強時會向水中釋放藻毒素導致生態系統失衡，危害人體健康[12，13]。因此，有效控制水體富營養化,防治水華成為環境領域需要深入研究的前沿和熱點問題。

化感物質是一類由植物或微生物產生的天然活性物質，具有易降解、高效性等優點，不會在生態系統中積累，生態安全性良好[14～16]。近期，國內外相繼開展了利用化感物質抑制銅綠微囊藻的研究，如Xiao等[17]從大麥秸稈中分離出的黃酮木質素(Salcolin)，對銅綠微囊藻具有抑制作用；Li等[18]發現從蘆葦中提取的2-甲基乙酰乙酸乙酯(EMA)能夠有效抑制銅綠微囊藻的生長；Nakai等[19]從穗狀狐尾藻中分離出水溶性多酚和脂肪酸，并證實以上物質對銅綠微囊藻具有強抑制作用；胡利靜等[20]使用水楊酸抑制銅綠微囊藻，同樣取得了良好的抑藻效果；趙倩名等[21]研究表明槲皮素、兒茶素、山奈酚、異鼠李素和木犀草素在一定程度上阻礙了銅綠微囊藻細胞的生長和對光的捕獲與吸收，從而導致其正常生理代謝功能紊亂。因此，本文選用香樟葉提取液以及加入聚丙烯酰胺緩釋劑后研究提取液對銅綠微囊藻生長的抑制效應，以期為揭示黃酮化合物抑制藻類生長的機理提供進一步的理論支持。

2 材料和方法

2.1 材料與儀器

香樟葉采自江蘇省鹽城市鹽塘河公園植物園內，所有化學試劑均為AR級。

2.2 銅綠微囊藻的培養

銅綠微囊藻使用BG-11培養液，其配制及用量見表2。

表2 BG-11母液成分及培養液配制用量

將銅綠微囊藻接種于BG-11培養液(用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌)，培養溫度25±2 ℃, 光照強度為12000×66%lx，光暗比12∶12，靜置培養，每天定時搖動。培養7 d后, 進入對數生長期。當藻生長到對數增長末期后，數其個數，在達到106個/mL后即可用于實驗。藻種每7 d轉接1次，使細胞始終處于旺盛的對數生長期，以備實驗使用。

2.3 實驗方法

在接有藻種的培養液中加入一定系列濃度的植物提取液，每天觀察藻的生長(測定藻個數、光密度)，由此分析提取液對銅綠微囊藻的生長是否有抑制作用。

2.4 數據處理

提取液對藻類的抑制率公式為:

IR(%) = (1-N/N0)×100%

(1)

式(1)中,IR為抑制率；N為加入提取液組藻密度；N0為對照組藻密度。

3 實驗內容

3.1 提取液的制備

采摘新鮮的香樟葉，洗凈，放于烘箱中30～40 ℃左右烘干，粉碎成粉。

準確稱取10 g左右的香樟葉粉末于燒杯中，加入適量的純凈水，浸泡48 h，超聲提取，減壓抽濾，定容成100 g(干重)/L，即為水提取液。4 ℃下保存待用。

準確稱取10 g左右的香樟葉粉末于燒杯中，加入適量的提取劑丙酮(甲醇)，浸泡48 h，超聲提取，減壓抽濾，濾液用旋轉蒸發器在35℃左右減壓蒸餾，以除去提取劑丙酮(甲醇)，剩余提取物用蒸餾水溶解并定容成100 g(干重)/L，即為丙酮(甲醇)提取液。4℃下保存待用。

制得200 g/L的香樟葉水提取液，以2 g聚丙烯酰胺/100 g提取液的比例加入緩釋劑，即為緩釋水提取液，4 ℃下保存待用。

3.2 化感作用實驗

取提取液為母液，稀釋為不同的濃度梯度，得到提取液的濃度系列。當藻細胞初始濃度為1×106個/mL左右時，在無菌條件下將提取液、藻種(5 mL)置于250 mL錐形瓶內,加入培養液使培養體系總體積為200 mL。光照培養箱培養條件光暗比：14∶10,溫度25±2 ℃。實驗期間每日定時搖動各錐形瓶兩次，同時隨機調換錐形瓶在培養箱中的位置。

3.3 藻生長量的測定

采用藻細胞計數和光密度2個指標表示藻生長量。細胞計數方法是用血球計數板在顯微鏡(10×40倍)下計數,平行計數2次,取平均值作為此樣品計數結果。光密度的測定方法是用722型分光光度計在波長650 nm下,以蒸餾水作為參比,測定藻液的吸光度A650。

4 實驗結果與討論

4.1 香樟葉水提取液對銅綠微囊藻生長的影響

與空白對照相比，加入香樟葉水浸提液后，銅綠微囊藻的生長都受到了一定程度的抑制，浸提液濃度越大，抑制作用效果越明顯。在光密度趨勢圖中，浸提物濃度為1 g/L、2 g/L、4 g/L的藻液光密度都大于對照組，而濃度為9 g/L、12 g/L藻液的光密度明顯小于對照組，7 g/L時，光密度與空白對照部分重疊，相差不大。光密度趨勢圖總體上表現為低促高抑作用(圖1～3)。

圖1 添加香樟葉水浸出液的銅綠微囊藻生長曲線的影響

圖2 添加香樟葉水浸出液的銅綠微囊藻光譜吸收曲線

圖3 添加香樟葉水浸出液的銅綠微囊藻抑制率曲線

4.2 香樟葉甲醇提取液對銅綠微囊藻生長的影響

香樟葉甲醇浸提液是對甲醇浸泡抽濾液在35 ℃下減壓蒸餾，基本去除甲醇溶劑后，用水溶解(不溶物超聲溶解)并定容為100g/L，這樣可以扣除溶劑甲醇對銅綠微囊藻生長的影響。另外，由于浸提液本身有顏色，對光密度有一定的影響，所以采取不加藻而提取物濃度相同的空白培養液作為背景，以扣除背景影響(圖4、5)。

圖4 添加香樟葉甲醇浸出液的銅綠微囊藻生長曲線的影響

圖5 添加香樟葉甲醇浸出液銅綠微囊藻光譜吸收曲線

不管是藻密度趨勢圖還是光密度趨勢圖，都可以看出，加入甲醇浸提液后，銅綠微囊藻的生長都受到抑制，而且浸提液濃度越大，抑制作用越強(圖6)。

圖6 添加香樟葉甲醇浸出液銅綠微囊藻抑制率曲線

藻密度趨勢圖中，1 g/L、2 g/L、4 g/L的浸提液中，藻的生長雖然受到抑制，但是抑制效果并不明顯，抑制率在50%上下徘徊，而8 g/L開始，抑制效果顯著上升，基本在80%左右(除了第2天，藻計數可能存在一定誤差)。而光密度趨勢圖也可以看出，1 g/L、2 g/L、4 g/L浸提液的吸光度也都處于大于0的狀態，8 g/L時，吸光度在0左右，而之后的濃度(12 g/L、16 g/L)吸光度都為負值。

4.3 香樟葉丙酮提取液對銅綠微囊藻生長的影響

丙酮提取液制作與甲醇提去液相似，既要扣除溶劑對銅綠微囊藻生長的影響又要扣除提取物本身顏色對吸光度的影響。

藻密度趨勢圖中，加入浸提液后，培養前期(2 d)，藻的生長量都很小，后期(3 d后)，低濃度的浸提液中藻開始明顯生長，而高濃度浸提液中藻細胞數依然很少。

藻生長穩定后(2 d后)，基本上所有濃度的浸提液中，銅綠微囊藻的抑制率都要超過50%，表現為顯著抑制，只有在后期(第7 d)，低濃度的浸提液才表現出抑制率快速下降的問題，這說明它們的作用不持久，而高濃度是相對比較穩定。

光密度趨勢圖中，基本上所有濃度的浸提物的吸光度都表現為負值(除了0.5 g/L的第6、7 d)，這說明丙酮浸提液抑制效果總體很好(圖7～9)。

圖7 添加香樟葉丙酮浸出液銅綠微囊藻生長曲線

圖8 添加香樟葉丙酮浸出液銅綠微囊藻光譜曲線

圖9 添加香樟葉浸出液銅綠微囊藻抑制率曲線

4.4 同一濃度不同溶劑提取液對銅綠微囊藻的生物量的影響

在3 g/L時，甲醇、水、丙酮浸提液都表現了抑制作用，而甲醇浸提液開始表現出抑制作用，所以采用3 g/L時3種溶劑的浸提液作為比較，以此來比較3種溶劑提取效果(圖10)。

圖10 添加相同濃度不同溶劑香樟葉浸出液銅綠

不同溶劑的提取液制作過程基本上消除了溶劑本身對銅綠微囊藻生長的影響，這樣可以直接通過藻的生長情況來判斷溶劑的提取效果。圖10即為3 g/L濃度時3種溶劑提取液抑制藻生長的抑制率趨勢圖，從圖中可以看出，丙酮的提取液抑制作用最好，水次之，甲醇抑制效果最低。

4.5 香樟葉水提取液加入緩釋劑聚丙烯酰胺對銅綠微囊藻生長的影響

在香樟葉水提取液加入聚丙烯酰胺，聚丙烯酰胺可以先將提取物包裹在凝膠組織中，在培養液中適時釋放，以達到與培養液中提取物濃度保持平衡，這樣既可以保證培養液中提取物的濃度保持在同一濃度，也可以使抑制作用時間持續長久一些。

香樟葉水浸提液中加入緩釋劑后，從藻密度趨勢圖中看出，濃度為4 g/L、8 g/L、甚至是12 g/L時，藻的密度都比空白對照組大，表現為促進作用。但是16 g/L開始，藻密度就急速降低，從抑制率趨勢圖可以看出，16 g/L開始，抑制率基本保持在50%以上，而且在抑制率趨勢圖中，可以看出，低濃度是浸提液的抑制率有上升的趨勢，開始表現為小的抑制作用。同樣，這樣的低促高抑的趨勢也可以在光密度趨勢圖中看出(圖11～圖13)。

圖11 添加香樟葉水浸提液緩釋后銅綠微囊藻生長曲線

圖12 添加香樟葉水浸出液緩釋后銅綠微囊藻光譜曲線

圖13 添加香樟葉水浸出液緩釋后銅綠微囊藻抑制率曲線

出現這種結果，可能一部分是因為提取液的抑制作用不夠明顯，另外，聚丙烯酰胺緩釋劑本身可能對藻的生長有一定的促進作用。實驗過程中，加入聚丙烯酰胺的藻培養液有寫粘稠，有部分藻黏在錐形瓶的底部，無法進行計數，這對藻密度的結果有很大影響，但是這也從另一個側面說明，聚丙烯酰胺可以促進藻類的絮凝沉降，那么，在實際應用中，聚丙烯酰胺可以作為絮凝劑，加速造的絮凝沉降，并在水體與底泥的界面上抑制藻類的生長。

4.6 同一濃度下有無緩釋劑對銅綠微囊藻生長的影響比較

4 g/L時，香樟葉水浸提液對銅綠微囊藻的生長表現為明顯的抑制作用，抑制率基本高于50%，而加入緩釋劑后，藻密度明顯增大，抑藻效率下降，甚至表現出促進藻類生長。這坑內一部分是因為藻沉積在錐形瓶底部，另外，聚丙烯酰胺對藻的生長可能有一定的促進作用(圖14)。

圖14 同一濃度下有無緩釋劑對銅綠微囊藻生長曲線影響比較

5 結論

(1)香樟葉的水、甲醇、丙酮等溶劑的提取液對銅綠微囊藻的生長都有一定的抑制作用，且提取液濃度越高，抑制效果越好。水提取液還表現出低促高抑的作用，分界濃度為7 g/L。

(2)香樟葉的水、甲醇和丙酮3種溶劑的提取液中，丙酮提取液的抑制效果最明顯，水次之，甲醇抑制效果最低。

(3)香樟葉水提取液加入聚丙烯酰胺緩釋劑后，對銅綠微囊藻生長也表現出一定的低促高抑作用，但是作用效果比水提取液抑制效果差，可能是因為聚丙烯酰胺本身對銅綠微囊藻的生長有促進作用，另外由于加入了聚丙烯酰胺，培養液有些粘稠，較多藻沉積在錐形瓶底部對藻的計數也有較大影響。