葉蛋白提取與應用的研究進展

史 可， 李研東， 王成祥， 霍惠玲， 高 山， 馬曉迪， 李丹丹， 韓 雪*

（1.河北科技大學食品與生物學院，河北 石家莊 050018；2.河北省獸藥飼料工作總站，河北 石家莊 050035；3.河北省健康主食產業技術研究院，河北 石家莊 051430；4.河北同福健康產業有限公司，河北 石家莊 051430）

葉蛋白是以綠色植物的莖葉為提取原料，經壓榨、浸提、蛋白質分離和濃縮干燥等步驟制備的蛋白質濃縮物（LPC）（高琦等，2020）。主要由葉綠體內基質蛋白和細胞質蛋白等組成，屬于“功能性蛋白質”（劉曉庚等，1999）。當前，大約有60多種植物莖葉可用于葉蛋白的提取，紫花苜蓿、桑葉、黑麥草、紫云英是研究與應用的常見種類（表1）。葉蛋白作為一類優質的蛋白質資源，其廣泛應用于食品、飼料、醫療等行業，可有效地緩解我國人均蛋白質攝入量不足的問題。近年來，葉蛋白研究多集中在提取方法優化和復合功能性物質分析等方面，并且研究內容逐漸深入。本文主要從葉蛋白的營養價值、提取方法、應用前景等方面概述其研究進展。

表1 常見葉蛋白的蛋白質含量及其應用

1 葉蛋白的營養價值

葉蛋白是綠葉植物中所特有的蛋白質，是在葉中形成的初始蛋白，與經過莖葉輸送、累積到籽實中的蛋白質相比，蛋白質的分子鏈更短，易于人體的消化吸收。其粗蛋白質含量一般可達30%~60%，所含氨基酸種類齊全，比例均衡，包含人體所需的8種必需氨基酸，且含量均較高。從營養學角度來看，幾乎完全符合聯合國糧農組織/世界衛生組織（FAO/WHO）推薦的人體需要的氨基酸模式。

除蛋白質外，葉蛋白還含有許多營養物質，如胡蘿卜素、葉黃素、維生素及多種礦物質元素等，具有抗氧化、促進消化吸收、降低膽固醇等功效。如西蘭花莖葉蛋白肽具有較好的降血脂活性（李露等，2019）。魯梅克斯葉蛋白酶解物具有一定的抗氧化效果，食用后可有效清除體內的自由基，減少自由基帶來的氧化損傷（李延琪等，2017）。且綠葉中含豐富的不飽和脂肪酸，非常符合人們當下的飲食理念。現我國已有研究采用一系列方法來制備其水解物，優化制備條件并進行成分分析，為葉蛋白資源的開發利用和精深加工提供實驗依據和技術參考。

2 葉蛋白的提取方法

植物體內的天然蛋白質一般穩定性都比較強，即使植物受到了一定的破壞，也不會對蛋白質的結構造成影響。在進行葉蛋白的提取之前，需要通過壓榨、酶法等手段破壞其穩定狀態，利用離心等多種方式實現蛋白質的沉淀，從而為后期的研究和應用提供條件（于群，2019）。目前用到的葉蛋白提取方法有很多，針對不同的葉蛋白需要采取不同的提取方式，在提取過程中一定要綜合考慮多種影響因素，選用合理的提取方法。

2.1 直接加熱法 直接加熱法是指蛋白質在高溫環境下受熱沉淀而提取蛋白質的方法。工藝流程圖如下：

該方法操作簡單易行，成本低，但是溫度過高會破壞蛋白質的結構使其變性，可能會降低蛋白質的活性以及提取率。呂富（2013）利用50~90℃逐漸升溫的加熱法提取水葫蘆葉蛋白，發現隨著溫度的升高，其葉蛋白得率不斷提高，50~70℃時升高幅度較大，70℃后葉蛋白得率不再升高，考慮到經濟效率與葉蛋白得率，提取溫度70~80℃最為適宜，葉蛋白得率可達1.52%，提供了一種水葫蘆葉蛋白提取的可行性方法。

2.2 酸（堿）化加熱法 酸（堿）化加熱法是將酸堿法和加熱法相結合的一種復合蛋白質分離方法，在等電點和熱變性雙重因素的作用下，葉片蛋白質的聚集效應和敏感性提高，導致葉片蛋白質快速聚集。工藝流程圖如下：

該方法蛋白質沉淀快、過濾收集較方便，但化學試劑會在一定程度上損害葉蛋白的營養成分，并對環境造成一定的影響。研究發現以酸化加熱法來提取紅萍葉、木薯葉、黑麥草、構樹葉、籽粒莧、黃麻等的葉蛋白效果較好（岑湘濤等，2020；楊有泉等，2013），提取率一般可達30%以上，提取效率高，但操作較繁雜，適用于實驗室提取。而堿化加熱法適用于提取含有大量等電點偏堿性的葉蛋白（王震等，2016），可以有效減少葉蛋白中的不利因子，并對葉黃素的穩定性有一定的保護作用；但一定程度上破壞了葉蛋白的結構，品質較差。這表明在制備葉蛋白時，需要根據想要得到的功能性質和實際應用選擇合適的提取工藝。

2.3 鹽析法 鹽析法是利用各物質在不同鹽溶液中的溶解度不同而沉淀析出。常用的中性鹽有硫酸銨、氯化鈉等，工藝流程圖如下：

該方法可在室溫下進行，操作簡單、成本較低，且可以較好的保持蛋白質的活性。但是整個提取過程耗時較長、效率低。陳秀清（2017）通過正交試驗優化不同方法提取南美蟛蜞菊葉蛋白的條件，結果表明鹽析法提取南美蟛蜞菊葉蛋白的得率最高，很好的保持了葉蛋白的活性，且適用于工業化和實驗室應用。楊豪（2021）通過硫酸銨沉淀法提取辣木葉蛋白，優化其提取條件，提取率可達13.49 mg/g。

2.4 發酵法 發酵法是利用菌種發酵液中的酸效應作為蛋白質沉淀劑使蛋白質提取液中的蛋白沉淀，通過離心分離得到粗蛋白質。工藝流程圖如下：

該方法不會產生有害物質，可以有效的減少環境污染，且發酵液中含有大量的微生物和生物活性大分子，如酶、菌肽、細菌素等，促進了其聚集作用，同時在一定程度上可降低粗蛋白質中有害物質的含量。但發酵時間較長，如果要大規模生產，就要求企業配備發酵設備，生產成本較高。屈紅森（2012）利用響應面優化枯草芽孢桿菌發酵法提取桑葉蛋白的條件，桑葉蛋白得率和蛋白質含量分別提高了10.57%和21.53%，且發酵后桑葉蛋白的體外消化能力也得到了顯著提高，桑葉蛋白的品質得到改善。

2.5 超聲波輔助法 超聲波輔助法是利用超聲波產生的空化、振動、粉碎、攪拌等輔以其他方法提取葉蛋白，加快蛋白的溶出，有效減少提取時間，提高提取效率，常與其他方法聯用。工藝流程圖如下：

有研究表明，超聲波輔助提取葉蛋白在蛋白質產量上優于非超聲法，且增強了蛋白質的乳化性、發泡性、吸油性、熱穩定性等功能特性（Saha等，2017）。許英一（2013）在堿法提取苜蓿葉蛋白基礎上加以超聲波輔助，并對工藝條件進行優化，粗蛋白質提取率可達51.09%，提高了提取率，并大大縮短了提取時間。職士淇（2020）應用超聲波輔助堿溶液、鹽溶液和水溶液提取苧麻葉蛋白的起泡性優于大豆分離蛋白，且超聲波輔助鹽提法提取率可達61.95%，為青葉苧麻葉的開發利用提供更多的理論依據。

2.6 其他 目前，提取葉蛋白的方法除了以上所提到的還有泡沫分離法、微波輔助法、酶輔助法、超高壓等，但由于這些方法有能耗大、不易操作、效率低等局限性，在實驗室和工業化生產中應用較少。劉龍（2017）以回收率和富集比為指標，利用泡沫分離技術提取菠菜葉中的蛋白質，并優化其提取條件，回收率和富集比可達81.56%、14.94。證明了泡沫分離技術是一種實現菠菜葉蛋白粗分離的有效的、低成本的方法，但是大多適用于低濃度，具有表面活性物質的分離提取。有關菠菜葉蛋白功能性質的改善及高濃度下的泡沫分離技術還需要進一步研究。Moreno-Nájera（2020）利用超聲波輔助、微波輔助、超高壓等技術提取菠蘿蜜葉蛋白，發現以0.5 mol/L NaCl為環境友好溶劑的超高壓法可獲得較高的蛋白質得率，提供了一系列綠色技術提取蛋白的可能性。

3 應用前景

3.1 飼用價值 植物葉蛋白廣泛應用于飼料生產，有效緩解了我國飼料行業資源短缺的現狀，改善了飼料的營養價值。我國的研究工作主要集中在苜蓿、黑麥草、桑葉等，均可簡單加工為優質蛋白飼料飼喂動物，也可作為添加劑加入到飼料中提高其營養價值。比如苜蓿、木薯葉蛋白富含各類氨基酸，可滿足動物的營養需求。不僅成本低，且提高了作物的附加值。食葉草也是近年來出現的一種蛋白質新資源，蛋白質含量高，氨基酸種類較為豐富，能夠滿足動物的生長需求，有巨大的發展前景。例如，飼料中添加濃縮苜蓿葉蛋白不僅可以提高飼料中蛋白質含量，也提高了牛奶中高純度多不飽和脂肪酸的氧化穩定性，利用此方法提高牛奶抗氧化水平來減少氧化（Fauteux等，2016）。范利花（2012）提取檸條葉蛋白后產生的殘渣采用混菌發酵，得到的發酵飼料是一種品質良好的動物飼料。整個過程操作簡單、成本低廉，改變了檸條的傳統利用方式。

3.2 食用價值 當今時代，人們逐漸意識到膳食結構對于身體健康的重要性，這導致葉蛋白作為原料在肉類替代品、乳制品類似物、休閑食品等產品中被廣泛應用。目前，已經出現了很多葉蛋白延伸產品，以及將提取所得葉蛋白以添加劑的方式應用于食品中，用以提高食品的營養價值，改善人們的膳食結構。如以小麥、綠豆和大米為原料，添加用雜交莧、辣木和白銀合歡3種不同葉片為材料制備混合葉蛋白濃縮物LPC制成斷奶食品。使食物更有營養，從而解決營養不良問題（Meda等，2017）。

3.3 醫用價值 除卻用作動物飼料與食品，很多葉蛋白表現出抑菌、防癌、降血脂等功效，對醫療行業的發展有一定的推動作用。近年來，研究將視線聚焦于葉蛋白內功能性物質的提取并對蛋白進行改性，研究其作用機制及其應用。如桑葉蛋白水解物通過整合腸道菌群和免疫功能來緩解結腸炎，維持腸道健康，降低結腸炎的風險（Sun等，2021）；苜蓿葉蛋白及其水解肽具有一定的抗氧化活性，同時具有降血脂、抗衰老、增強免疫力等功能，已有研究者采用一些小分子糖類物質對苜蓿葉蛋白進行糖基化改性，有效改善了苜蓿葉蛋白的功能特性，拓寬了其應用范圍；辣木葉蛋白對四氧嘧啶誘導的糖尿病小鼠具有降血糖和抗氧化作用，對小鼠無急性毒性，是一種很有前途的糖尿病替代或補充藥物（Paula等，2017）。

4 結束語

葉蛋白來源廣泛，營養豐富。近年來對于葉蛋白的研究，提高了作物的附加值，最大程度上利用了作物資源，緩解了我國蛋白資源短缺的現狀，進一步完善優化了國民膳食結構。目前已有很多提取葉蛋白的方法，提取率在逐漸提升，但大多僅限于實驗室應用，產業化應用方法比較局限，仍然需要進一步研究產業化生產中如何降低原料成本和能耗，提高提取效率。且大部分葉蛋白制品普遍為深綠色或棕色，有一定青草味，顏色和口感均限制了其應用范圍及商業價值。現在常用到吸附法、有機溶劑和超臨界CO2流體萃取技術等進行脫色，獲取高品質葉蛋白。采用有機溶劑法脫色分離對溶劑消耗量大，成本較高；而超臨界CO2流體萃取以CO2為萃取劑，設備投資較高。現用的提取和脫色方法均存在一定的缺陷，且在加工過程中如何最大限度保護維生素、活性物質等有效成分，去除葉蛋白制品中的抗營養物質和毒素，保證葉蛋白的營養性和安全性是有待解決的問題。因此探索低成本、安全、高效的提取和脫色方法是獲取高品質葉蛋白的必要途徑。