響應面法優化飼用屎腸球菌QW256增殖培養條件

郭建軍， 袁 林， 熊大維， 黃國昌， 曾 靜*， 王振希

（1.江西省科學院微生物研究所，江西 南昌 330096；2.南昌工程學院理學院，江西 南昌 330099）

屎腸球菌（Enterococcus faecium）屬于乳酸菌中的腸球菌，革蘭氏陽性，需氧或者兼性厭氧菌，菌落呈圓形或者橢圓形，無芽孢和鞭毛，生長迅速，代謝乳酸，通常定植在動物消化道內的回腸和結腸部位，為腸道正常優勢菌群（彭眾等，2018）。基于其具有耐胃酸、耐熱性強、耐藥性強等優良生物學特性，可在腸道中形成優勢菌群和與腸道表面黏附形成保護屏障，產生有機酸降低腸道pH和一些抗菌物質抑制有害菌，調節腸道微生物菌群平衡，降低腹瀉率與死亡率，以及促進反芻動物瘤胃發酵，抑制有害微生物生長，作為抗生素的替代品已被廣泛應用于畜牧業生產中（白天天等，2021），有著良好的飼用前景。

高密度培養核心在于為菌體提供合適的營養成分和生長條件，獲得較高菌株菌體密度，降低菌株培養成本和縮短生產周期，從而實現高密度、高產率和高濃度培養（聶黔麗等，2021）。不同屎腸球菌菌株對其生長條件存在較大差異，影響其高密培養的因素較多，包括培養基的成分（氮源、碳源、無機鹽和生長因子）和基礎培養條件（培養溫度、初始pH、溶氧濃度）等。實驗室前期從健康仔豬腸道內分離篩選得到一株產γ氨基丁酸屎腸球菌QW256，根據兼具益生特性與開發潛力的屎腸球菌QW256的生長需求，從增殖培養基篩選和培養條件2個方面，以活菌數為響應指標，通過單因素試驗，Plackett-Burman試驗，最陡爬坡試驗以及中心組合設計試驗與響應面分析法，對屎腸球菌QW256培養條件及培養基組分進行優化，旨在獲得最優的培養基配方和適宜的培養條件，為其工業化應用提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株資源 屎腸球菌QW256來自江西省環境微生物與生物技術重點實驗室。

1.1.2 培養基MRS液體培養基：葡萄糖20 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物8 g/L、牛肉膏5 g/L、乙酸鈉5 g/L、檸檬酸三銨2 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、吐 溫-80 1 mL/L、MnSO4·H2O 0.058 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L，pH 6.2~6.4。固體培養基添加瓊脂20 g/L。

發酵培養基：在MRS培養基基礎上，改變碳源、氮源、無機鹽等，各成分的量隨試驗設計的變化而不同。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株培養 將屎腸球菌QW256甘油保存管于MRS培養基上劃線活化，37℃培養24 h；挑取單菌落接種至MRS液體培養基中，37℃、120 r/min培養16 h后獲得種子液。發酵培養基成分根據試驗方案逐次改變，向發酵培養基中接入3%的種子液，37℃發酵培養24 h，測活菌數。參照國標GB 4789.35—2016按照MRS瓊脂平板傾注法檢測活菌數。

1.2.2 單因素試驗 培養條件的優化：接種量、培養溫度和發酵初始pH是影響乳酸腸球菌高活菌數培養的重要因素。取種子液以一定的接種量轉接到有300 mL MRS培養基的500 mL藍口瓶中，一定溫度下于120 r/min培養20 h后測定發酵液的活菌數和pH，依次考察不同接種量（1%、3%、5%、7%、9%）、不同培養溫度（30、32、35、37、40、42℃）和不同初始pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）對菌活菌數的影響。

發酵培養基組分優化：分別以20 g/L葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖漿、玉米淀粉和糖蜜等替代MRS培養基中的碳源，在已優化培養條件下培養20 h，以活菌數為考察指標，確定碳源。在篩選出最佳碳源基礎上，考察碳源添加量（5、10、15、20、30、40 g/L）對菌株生長的影響；然后依次考察不同氮源種類（酵母浸粉、牛肉膏、胰蛋白胨、玉米漿、黃豆餅粉和硫酸銨）、不同類別緩沖鹽體系（檸檬酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽等）、微量元素、促生長因子對菌株生長狀況的影響。

1.2.3 Plackett-Burman設計 在前期單因素試驗的基礎上，選高低2個水平，以（-1、1）編碼各值，其中高水平是低水平的1.5倍，以培養后發酵液活菌數為響應值進行試驗分析，計算各因素效應和重要性評價，篩選出對屎腸球菌發酵液活菌數具有顯著性影響的因素。

1.2.4 最陡爬坡試驗 根據PB試驗結果設定各因素的步長及變化方向進行試驗，使其成梯度變化，檢測各個梯度下發酵液活菌數，逼近最佳區域，確定下一步中心組合設計試驗中因素的中心點。

1.2.5 中心組合設計試驗 根據最陡爬坡試驗找出試驗的顯著因素與水平，顯著因素響應區域的中心點為零水平，采用Box-Behnken中心組合設計，設計3因素5水平的響應面分析試驗并對數據進行處理，每組重復3次，取平均值作為試驗結果。

1.3 數據處理與統計分析 所有試驗均重復3次，結果以“平均值±標準偏差”表示。通過Design-Expert 8.0.6軟件對回歸模型進行方差分析和可靠性分析。

2 結果與分析

2.1 培養條件對菌株屎腸球菌QW256生長的影響 由圖1B可知，隨著接種量的增加，屎腸球菌QW256菌株生長培養發酵液活菌數呈現先升高后降低的趨勢，接種量為5%時活菌數達到最大值，因此選擇5%為最適接種量。由圖1C可知，當培養溫度為29～37℃時，隨著溫度的升高活菌數逐漸升高；當發酵溫度高于39℃之后，活菌數迅速下降。因此，最佳發酵溫度為37℃。由圖1D可知，隨著MRS初始pH的升高，發酵液活菌數呈先升高后降低的趨勢，在初始pH為7.0時，活菌數達到最高；但初始pH為6.5～7.5時，活菌數沒有顯著區別，因此，選擇初始pH為7.0。

圖1 不同培養條件對菌株屎腸球菌QW256生長的影響

2.2 增殖發酵培養基組分對菌株屎腸球菌QW256生長的影響

2.2.1 不同碳氮源對菌株屎腸球菌QW256生長的影響 培養基中碳源和氮源成分及其適宜添加量的選擇是改善乳酸菌生長的手段。在以MRS為基本培養基上，改變碳源、氮源，進而篩選合適屎腸球菌QW256生長的碳源和氮源。本著工業生產成本最低化原則，篩選發酵乳酸菌常用到的碳氮源，結果見表1。

表1 不同碳氮源對菌株屎腸球菌QW256生長的影響

由表1可知，屎腸球菌QW256在以葡萄糖為碳源的培養基內生長較好，發酵后活菌數最高，為9.16×108CFU/mL，與 糖 蜜試驗組9.10×108CFU/mL無顯著差異（P＞0.05），二者與其余各組存在顯著差異（P＜0.05），說明屎腸球菌QW256比較適合在以葡萄糖或糖蜜為碳源的培養基內生長。綜合考慮工業生產成本選擇糖蜜作為碳源進行下一步研究。

屎腸球菌QW256在以酵母粉和玉米漿為單一氮源時發酵液活菌數明顯高于其他試驗組（P＜0.05），酵母提取物和玉米漿試驗組間不存在顯著性差異（P＞0.05）；以酵母粉和玉米漿為屎腸球菌QW256生長氮源進行復配優化時，酵母提取物和玉米漿以1∶2比例復配時發酵液活菌數達到最大，顯著高于其他試驗組（P＜0.05）。

2.2.2 緩沖鹽體系和微量元素對菌株屎腸球菌QW256生長的影響 由表2可知，檸檬酸-檸檬酸鈉試驗組發酵液活菌數顯著高于其他試驗組（P＜0.05），其他組與MRS對照組不存在顯著性差異（P＞0.05），表明檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖體系能夠在一定程度上促進屎腸球菌QW256菌體增殖；微量元素通常作為酶或者活性物質的組成部分或者激活劑發揮作用，發現培養基內加入精氨酸、Mg2+對屎腸球菌生長有促進效果，故在優化培養基選擇加入硫酸鎂和精氨酸。

表2 緩沖鹽體系和微量元素對菌株屎腸球菌QW256生長的影響

以碳源及氮源的結果得到初優培養基：糖蜜20 g/L、酵母粉8 g/L、玉米漿16 g/L。通過培養基中其他營養物質試驗結果及乳酸腸球菌生長特點的分析，確定檸檬酸0.25 g/L、檸檬酸鈉4.5 g/L、硫酸鎂0.6 g/L及精氨酸0.2 g/L添加到初優培養基進行PB試驗。

2.3 兩水平部分因子設計篩選影響屎腸球菌QW256生長的主要影響因子 以屎腸球菌QW256活菌含量（108CFU/mL）為響應值進行Plackett-Burman試驗設計，試驗設計方案及結果見表3。對試驗結果分析，得到回歸模型方差分析和各因素的主效應見表4。

表3 PB試驗設計及結果

由表4可知，該模型的決定系數為96.52%，校正后的決定系數91.36%＞70%，并且模型的P值為0.0033，證明模型與實際情況擬合較好。糖蜜、酵母粉、檸檬酸、檸檬酸鈉、硫酸鎂、接種量和初始pH為正效應，選擇它們的高水平應用到后續試驗中；玉米漿、精氨酸、培養溫度為負效應，選擇它們的低水平應用到后續試驗中。從P值來看，糖蜜在置信區間P<0.01影響顯著，檸檬酸鈉和初始pH在置信區間0.01

表4 PB試驗各因素主效應分析結果

2.4 最陡爬坡試驗確定響應面最優鄰域 根據Plackett-Burman試驗的結果發現糖蜜、檸檬酸鈉和初始pH因素都呈顯著正效應，變化方向為各因素濃度梯度遞增，進行最速上升試驗。表5的結果表明，最大活菌數在第4次試驗附近，故采用糖蜜22.5 g/L，檸檬酸鈉4.9 g/L，初始pH 7.6進行后續工藝優化試驗。

表5 最速上升試驗設計及結果

2.5 中心組合設計優化屎腸球菌QW256生長的關鍵因子 以糖蜜、檸檬酸鈉和初始pH 3個顯著影響因子作為響應面設計的自變量，以培養后發酵液活菌數作為響應值進行中心組合設計3因素5水平的Box-Behnken試驗，試驗設計和結果如表6所示。

表6 屎腸球菌QW256增殖條件優化中心組合試驗設計及結果

由Design-Expert 8.0.6軟件擬合得到多元回歸模型，試驗因子對響應值的影響可用回歸方程表 示 為：R=-469.986-0.995X1+14.443X2+117.19X3+0.334X1X2+0.312X1X3+3.682X2X3-0.063X12-4.978X22-9.252X32，回歸方程的參數估計和方差分析見表7。

表7 中心組合試驗回歸模型的方差分析

由表7可知，調整確定系數R2adj=0.8703與確定系數值R2=0.9211較為接近，表明該模型活菌數的預測值和試驗值之間的擬合度良好；精密度Adeq Precision=8.379>4，說明該模型響應信號強，可用于擬合上述試驗結果，CV=1.59%，說明總變異中只有1.59%不能用此模型進行解釋，不能擬合情況可以忽略；二次多項式模型P值為0.0089，極顯著（P<0.01），失擬項的P值為0.2774（P>0.1），差異不顯著，說明該模型能夠涵蓋所有試驗數據，試驗精確度強及可信度高，可以用該模型對試驗結果進行分析及預測最大值。

2.6 響應曲面分析確定最佳濃度及驗證試驗由圖2可見，響應面三維立體圖均為光滑的曲面，且開口向下，X1、X2、X3存在極值點，說明區域在所設計的響應面范圍覆蓋了最大值，能夠找到活菌數的最大值，響應面立體圖曲線較為彎曲，說明因素兩兩之間交互作用顯著，各因素對結果影響較大；使用Goal Maximize命令對R進行嶺脊分析，當3個因子最優試驗點（X1、X2、X3）的代碼值（0.87、0.52、0.76）時，得出回歸模型存在的最大估計值為：活菌數最大值為1.073×1010CFU/mL，即與其對應的是糖蜜24.7 g/L，檸檬酸鈉5.1g/L，初始pH 7.7。

圖2 各因素交互作用響應面圖

為了驗證最優屎腸球菌QW256生長條件和過程工藝參數的控制主要包括對發酵溫度、發酵時間、接種量、培養基pH的調控，本試驗中屎腸球菌QW256的最佳接種量為5%、最適培養溫度為37℃、最適初始pH為7.7。

為了驗證最優屎腸球菌QW256生長條件和增菌效果的可靠性，按照優化后的條件，以初始MRS培養基為對照進行驗證試驗，其活菌含量、發酵液pH的變化曲線結果如圖3所示。屎腸球菌QW256在MRS和優化培養基中的生長曲線可以看出，延遲期由7 h提前到3 h，穩定期由18 h提前到14 h，對數生長期延長了2 h，整個發酵培養周期時間縮減3 h，證明優化后的培養基更加有利于菌株屎腸球菌QW256的生長：整個生長周期中MRS培養基的最大活菌濃度為3.36×109CFU/mL，優化培養基最大活菌濃度為1.12×1010CFU/mL，與模型預測值非常接近，表明該模型能很好地預測實際的發酵情況。而pH變化曲線可以看出，pH在對數期時下降速率較快，菌體增殖產生的大量有機酸的速率增加較快，且與細胞生長呈現相關性。

圖3 屎腸球菌QW256的生長曲線

3 討論

乳酸菌菌劑制備的關鍵在于其高密度培養，影響高密度培養的因素有菌種特性、培養基成分、培養過程工藝參數的控制以及培養模式等，增菌培養基的優化是高密度培養的基礎。乳酸腸球菌的營養要求復雜，通過培養基的改良或額外添加營養物質（如氨基酸、核苷酸、維生素等），并且需要營養物質濃度恰當合理，才能有效促進菌體增殖。本試驗中，在以MRS為培養基 的基礎上進行改良與添加營養物質，以糖蜜為碳源、酵母粉和玉米漿為氮源、檸檬酸鈉鹽為緩沖鹽體系、營養因子（精氨酸）等營養物質作為屎腸球菌QW256培養基時，緩解發酵液pH降低對菌株生長的抑制作用，延長菌體對數生長期，獲得較高的生物量。培養過程工藝參數的控制主要包括對發酵溫度、發酵時間、接種量、培養基pH的調控，本試驗中屎腸球菌QW256的最佳接種量為5%、最適培養溫度為37℃、最適初始pH為7.7。

本試驗在MRS培養基的基礎上進行單因素試驗，確定適合該屎腸球菌生長的最優培養工藝參數（接種量、培養溫度、培養時間等），以及該菌的最適培養基成分（碳源、氮源、緩沖鹽體系、生長因子、微量元素等）；通過Plackett-Burman試驗設計分析篩選影響屎腸球菌發酵活菌數的顯著影響因子，利用最陡爬坡試驗逼近顯著因子的最大活菌數響應區域，最后采用中心組合試驗設計和響應面分析法得到顯著影響因子的最優配比。本試驗通過優化屎腸球菌QW256培養基及培養條件，在最佳條件下進行發酵培養得到的活菌數為1.12×1010CFU/mL，高于陳志娜等（2021）高密度培養屎腸球菌R2后的活菌數1.33×109CFU/mL和采用單因素及響應面試驗對屎腸球菌Y1增殖培養條件及培養基進行優化得到活菌數2.90×109CFU/mL（苑園園等，2021）。

4 結論

本研究以工業化生產為出發點，采用單因素試驗、Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗、中心組合設計試驗以及響應面分析對屎腸球菌QW256培養條件和高密度培養基配方進行優化，確定菌株屎腸球菌QW256的最佳增殖培養條件為接種量5%、培養溫度37℃、初始pH 7.8，菌株屎腸球菌QW256優化培養基成分為：糖蜜24.7 g/L、酵母粉10 g/L、玉米漿16 g/L、檸檬酸0.25 g/L、檸檬酸鈉5.1 g/L、硫酸鎂0.6 g/L及精氨酸0.2 g/L。在優化后培養條件下培養17 h時發酵液活菌數為1.12×1010CFU/mL。