青貯蘆葦益生菌添加劑配方的篩選

熊志達， 周鑫鑫， 楊書敏， 王金碩， 肖運才， 石德時

（華中農業大學，湖北 武漢 430070）

蘆葦屬多年生根莖型的高大禾本科植物，廣泛分布于濕地生態系統，蘆葦根莖發達，生長旺盛，再生速度快，具有極強的適應環境的能力，我國現有14個蘆葦的主產區，蘆葦面積可達130萬公頃以上（朱作華，2017；李建國，2004）。春夏兩季蘆葦的營養價值豐富，具有很高的粗蛋白質含量。鮮嫩的莖葉對于反芻動物具有較好的適口性，因此春夏兩季的蘆葦可作為反芻動物的優質青綠飼料（項迪平，2021）。

蘆葦中有較高的纖維素含量，生長期蘆葦中中性洗滌纖維（NDF）含量可達到71.96%~72.81%DM，酸性洗滌纖維（ADF）含量約為37.94%~39.50% DM（康翠翠，2016），每年僅有少部分的蘆葦用于反芻動物飼喂，部分蘆葦用在造紙、編席和制作掃帚等經濟用途中，大部分蘆葦則被廢棄。因此，開展對蘆葦保鮮和體外降解纖維素含量的研究，對于合理開發利用蘆葦資源，緩解決我國反芻動物飼料缺口問題和發展養殖業具有重要意義。

根據我國養殖業飼料缺口亟待解決的現狀，以及蘆葦作為青貯飼料利用的可行性，本研究利用從水牛瘤胃中篩選出來的兩株產纖維素酶的益生菌：副地衣芽孢桿菌（Bacillus paralicheniformis）SN-6和短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）D1，與其他適宜飼料青貯的益生菌復配，期望通過乳酸菌保存蘆葦中營養物質的同時，產纖維素酶的益生菌可以有效地降低蘆葦中的纖維素含量，從而達到蘆葦保鮮和體外降解部分纖維素的目的，并根據青貯發酵的結果，獲得最適宜蘆葦青貯的益生菌添加劑配方。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 蘆葦：收割處于生長前期距離根部40 cm以上的全株蘆葦。菌株：副地衣芽孢桿菌（Bacillus paralicheniformis）SN-6（本研究團隊從水牛瘤胃中分離得到，菌粉活菌數為1.0×1010CFU/g）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）D1（本研究團隊從水牛瘤胃中分離得到，菌粉活菌數7.0×109CFU/g）、布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）LB101（購于微康益生菌蘇州股份有限公司，菌粉活菌數為1×1010CFU/g）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）LP194（購于微康益生菌蘇州股份有限公司，菌粉活菌數為1.0×1010CFU/g）、象草發酵劑[采購于華大瑞爾科技有限公司，內含有乳酸片球菌 （Pediococcus lactis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）TL和 酵 母 菌（Yeast）等益生菌，菌粉活菌數為1.0×109CFU/g）]。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同生長階段蘆葦營養物質變化2020年6月5日~8月27日間，不定期收割處于生長期各階段的蘆葦，通過檢測營養成分，確定最佳的蘆葦收割時間。將樣品65℃烘干后，檢測生長期不同階段蘆葦營養物質的變化。

1.2.2 蘆葦青貯試驗 收割處于生長前期的蘆葦（2021.06.04），將其粉碎至1~3 cm長。蘆葦鮮樣中含水量為（65±0.52）%，額外添加水（4±0.50）%，使總水量控制在70.0%左右。此外，菌添加總量設置為3×109CFU/kg，按照表1菌劑添加量，將菌劑添加入蘆葦中，并根據蘆葦鮮重額外添加2%糖蜜拌勻，每個密封袋中填裝1 kg蘆葦，用真空打包機將密封袋抽至真空形成完全封閉的空間，各組設置3個平行處理，同一菌添加劑組放入同一個帶蓋的密封桶中。在桶上記錄日期與菌添加情況，放置陰涼處青貯20 d后，開桶檢測各組青貯樣品的發酵品質與營養物質。

表1 各組菌添加量

1.2.3 蘆葦青貯樣品品質測定 氨態氮的含量按照T/NAIA 001—2020的方法測定。乙酸、丙酸、丁酸的含量按照GB/T 22145—2008的方法測定。pH與總酸的含量按照GB/T 12456-2008（3）的方法測定。乳酸的含量按照GB/T 5009.157—2016的方法測定。粗蛋白質的含量按照GB/T 6432—2018的方法測定。干物質的含量按照GB/T 6435—2014的方法測定。粗灰分的含量按照GB/T 6438—2007的方法測定。中性及酸性洗滌纖維的含量按照GB/T 20806—2006的方法測定。毒素的含量使用黃曲霉毒素B1快速檢測卡、嘔吐毒素快速檢測卡、玉米赤霉烯酮快速檢測卡測定，檢測卡均購于武漢觀銳生物科技有限公司。

1.3 青貯飼料的品質評定

1.3.1 感官評定 青貯飼料的氣味、色澤和結構按照德國農業協會（DLG）評分法進行評分（張養東，2016），將青貯得分分為1級優良（16~20分）、2級尚好（10~15分）、3級中等（5~9分）、4級腐?。?~4分）四個等級。

1.3.2 發酵品質評定 青貯飼料的發酵品質按照弗氏評分法（德國科學家Flieg在1938年提出的評定方法）進行評定（英華，2010）。按照得分情況將青貯蘆葦分成優（81~100分）、良（61~80分）、可（41~60分）、中（21~40分）和劣（0~20分）五個等級。

2 結果與分析

2.1 處于生長期不同階段的蘆葦營養物質變化根據圖1可知，在蘆葦生長過程中，隨著蘆葦老化，水分不斷降低（2020.07.17所測蘆葦樣本水分含量達到71.92%，可能與當時雨水較多有關）；灰分先升高后降低；粗蛋白質先升高后降低，最高可達15.68%。綜合生長期蘆葦水分和蛋白質含量變化，結合實地觀察蘆葦生長情況，得出6~7月份是收割蘆葦進行青貯發酵的最佳時期。

圖1 2020年6月5日-2020年8月27日蘆葦營養物質變化

2.2 蘆葦青貯試驗結果分析

2.2.1 蘆葦鮮樣營養物質 表2為處于生長前期蘆葦樣品的營養物質含量，此時的蘆葦鮮樣中有較高的營養價值，粗蛋白質含量為15.38%；纖維素含量較高，NDF約為71.0%，ADF含量約為40.09%。

表2 青貯前蘆葦樣品營養成分

2.2.2 蘆葦青貯感官評價 在為期20 d蘆葦青貯試驗結束后，將所有桶中的青貯袋取出并打開。發現打開的青貯袋內散發著蘆葦青貯后特有的酸香味；青貯后的蘆葦松散不干燥，濕潤不黏手，用力擠壓青貯蘆葦僅有少量液體從指縫間滲出；除了Ctrl組發酵后莖葉結構保存得較差外，益生菌添加劑各組的莖葉結構保存均為良好（表3）。青貯后的蘆葦飼料較新鮮蘆葦略有變色，呈黃綠色，烘干后呈淡褐色。

表3 青貯蘆葦的感官評價

2.2.3 蘆葦青貯品質評價 由表4可知，各組的pH均屬于優良發酵的水平（pH=3.8~4.2）。菌添加劑各組TA含量極顯著高于Ctrl組（P<0.01），XS64組TA含量最高，達到5.84 g/kg DM，其LA含量也顯著高于其他組（P<0.05），達到3.22 g/kg DM。BA含量是飼料青貯過程中是否發生腐敗的重要標志之一，優質的青貯發酵飼料中，BA的含量應小于1% DM并無限接近于0，Ctrl組中BA含量為0.14% DM，復合益生菌添加劑各組BA含量均小于0.10% DM。AN的含量標志著飼料青貯過程中發生腐敗的程度，青貯飼料中AN含量越低則說明飼料中蛋白質腐敗程度越低。此次青貯試驗中各組AN含量均小于0.1% DM。

表4 青貯蘆葦的品質

2.2.4 蘆葦青貯營養物質評價 由表5可知，XS64組青貯后DM含量高于其他組，可達到35.88% DM（P<0.05）。XS55的CP含 量 為12.35% DM，XS64的CP含量為12.60% DM，XSD的CP含 量 為12.67% DM，BZSD的CP含 量 為12.73% DM，Ctrl的CP含量為13.83% DM，表明通過青貯可有效地保存蘆葦中的營養物質。

表5 青貯蘆葦的營養物質

此外，添加降解纖維素分解菌（SN-6、D1）可以有效地降低蘆葦中NDF含量。其中XS64降低NDF含量最多，較Ctrl組降低了4.74%（P<0.01）。其他添加產纖維素降解酶益生菌的各組NDF含量較Ctrl組均有下降的趨勢：XS55組NDF含 量 較Ctrl組 降 低2.93%（P<0.05）；XSD組NDF含量較Ctrl組降低約為2.83%（P<0.05）；BZSD組NDF含量較Ctrl組降低約為1.79%（P<0.05）。各組均無顯著降低ADF的效果。

2.2.5 青貯蘆葦的發酵品質 根據表6可知，XS55組LA/TA的含量最高，為56.26%；XS65中LA/TA含量為55.22%；XSD組LA/TA為52.57%；BZSD組LA/TA為45.22%；而直接青貯Ctrl組中LA/TA含量僅為7.07%。XS55組BA/TA含量為0.04%；XS64組BA/TA含量為0.40%；XSD組BA/TA含量為0.10%；BZSD組BA/TA含量為0.11%；Ctrl組中BA/TA含量最高，為15.29%。

表6 青貯蘆葦的發酵品質 %

AN/TN這一指標可評價青貯飼料的發酵品質，該值<5.0%，青貯飼料發酵品質為優，5%~10%為良好，10%~15%為中等，>15%為差，除了Ctrl組外其他各組的AN/TN含量均小于10%，結合實際觀察，各組腐敗程度均較低，發酵情況均屬于“良好”。Ctrl組與各益生菌添加劑組之間AN/TN含量有顯著差異性，為13.62%（P<0.05）。

2.2.6 蘆葦青貯毒素含量 表7為蘆葦青貯樣品的三種飼料毒素的檢測結果，由于蘆葦飼料國家標準尚未制定，因此使用玉米、麩皮和豆粕的毒素檢測標準（DON≤1.0 mg/kg；AFB1≤20.0 μg/kg；ZEN≤400.0 μg/kg）來評價蘆葦青貯樣品是否毒素含量超標。經試驗檢測，各組檢測結果均達到常規飼料的毒素驗收標準。

表7 青貯蘆葦的毒素含量

2.3 蘆葦發酵品質評價 根據費氏評分法對各組蘆葦青貯樣品發酵品質的平均值進行評分與等級劃分（表8）。其中XS64組評分最高，為86分，評價為“優”。同時，XS55組也具有同樣的優秀品質，評分為85，評價為“優”。此外其他兩個益生菌添加組XSD組和BZSD組的評價均為“良”。Ctrl組品質差，乳酸占總酸含量極低，為7.07%，弗氏評分法的得分最低，為7分，青貯品質評價為“劣”。

表8 青貯蘆葦的弗氏評價

3 討論

3.1 乳酸菌對蘆葦青貯的影響 此次蘆葦青貯各處理組pH均在3.80~4.20，以pH值評分標準（中國）（劉建新等，1999）對各組進行評分，XS55組和XS64組等級為優等；Ctrl組和BZSD組青貯等級為良好。青貯中的有機酸含量及其構成，是反映青貯發酵品質最關鍵的指標。評價有機酸含量的重要指標為乳酸、乙酸、丙酸和丁酸（金華平，2013）。其中乳酸含量占比越高則說明青貯效果越好。各益生菌添加劑處理組中乳酸含量均極顯著高于Ctrl組。丁酸由多種腐敗菌分解蛋白質產生，丁酸被牛瘤胃壁吸收，轉化為β-羥丁酸并導致奶牛酮病的發生。Ctrl組丁酸/總酸含量最高，為15.29%，其他復合益生菌添加劑處理組丁酸/總酸含量均小于1%。因此，添加活性乳酸菌可顯著地提高蘆葦青貯中乳酸的含量，并可以有效抑制腐敗菌的生長從而降低丁酸的含量。氨態氮/總氮可反映青貯料中粗蛋白質與氨基酸的分解程度，益生菌添加劑各組的氨態氮/總氮的比值含量極低，均顯著低于Ctrl組（P<0.05）。研究表明，在蘆葦青貯過程中添加乳酸菌，可有效降低蘆葦的pH，同時抑制其他腐敗菌所造成的不良發酵，蘆葦中的營養物質得到了較為完整的保存。

3.2 產纖維素降解酶的益生菌對蘆葦青貯的影響 中性洗滌纖維（NDF）主要是細胞壁成分，NDF可作為評估青貯飼料精粗比的一個重要指標。酸性洗滌纖維（ADF）包括纖維素、木質素和硅酸鹽等，當ADF含量適中時，能夠有效的促進動物的消化作用；當其含量過高時，則會導致其他營養物質的消化利用率降低（晁洪雨，2012）。本研究結果表明，添加產纖維素降解酶益生菌的各組青貯飼料中的NDF含量顯著降低（P<0.05），這可能與D1、SN-6所產生的纖維素酶與漆酶有關。此外，益生菌添加劑的各組中乳酸含量比Ctrl組含量更高，其原因可能是纖維素被D1和SN-6降解利用后，進一步為乳酸菌提供了青貯發酵的底物葡萄糖。

4 結論

本試驗結果表明，復合益生菌添加劑具有保存蘆葦中的營養物質和生理性狀、提高飼料風味、降低pH、抑制腐敗菌生長、降低蘆葦中NDF含量等作用。