無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉生長、消化及蛋白質代謝相關理化指標的影響

彭祖想， 嚴 林， 衛力博， 王悅晗，

高 欣1，2， 王 偉1，2，3， 任同軍1，2，3， 韓雨哲1，2，3*

（1.大連海洋大學水產與生命學院，遼寧 大連 116023；2.大連海洋大學，水產動物營養與飼料實驗室，遼寧 大連 116023；3.大連海洋大學，遼寧省北方魚類應用生物學與增養殖重點實驗室，遼寧 大連 116023）

魚粉是一種氨基酸組成合理的優質動物蛋白，被水產飼料行業廣泛使用。然而近年來由于魚粉資源的匱乏和高昂的價格導致了魚粉資源的不穩定性，一定程度上限制了水產養殖行業的可持續發展。當今迫切的需要開發一種蛋白含量高、價格低廉、易獲得且供應穩定的新型飼料蛋白源以滿足水產飼料行業的需求。家禽副產品粉（PBM）是家禽屠宰之后的下腳料，經提煉油脂和粉碎后得到的粉狀產品，在營養組成上與魚粉相似且價格低廉，與植物性蛋白源相比不含抗營養因子，因此被認作是一種潛在的魚粉替代源（Thompson等，2007）。國內外對草魚（Thompson和Butt，2012）、鯰（Giri等，2010）、駝背鱸（Shapawi等，2007）、軍曹魚（Zhou等，2011）和大口黑鱸（馬利等，2021）等水產動物上的研究結果表明，PBM可在一定程度上替代魚粉。但PBM的原料組成較為多樣，包括頸部、腳部、腸道及未發育蛋等，因此PBM的質量取決于原料的質量和加工方式并且因批次和供應公司而異，可能存在某些必需氨基酸的不足（Chaklader等，2020、2019；Hill等，2019）。雞腸粉（CGM）是PBM的一種，是以新鮮雞腸為單一原料，經沖洗、蒸煮、噴霧干燥和粉碎等工序加工而成的新型優質飼料蛋白源。優質的雞腸粉粗蛋白質和粗脂肪含量與魚粉接近，部分氨基酸含量甚至高于魚粉，但仍缺乏一些必需氨基酸如賴氨酸（Lys）和蛋氨酸（Met）。研究人員在尋找合適的魚粉替代物時通常是從普通動植物蛋白源中選擇的，但普通動植物蛋白源普遍缺乏一些必需氨基酸，因此補充晶體氨基酸以平衡飼料中氨基酸的組成，成為獲得理想蛋白源的一種重要途徑（劉韜，2018；陳庭，2015；冷向軍等，2009），但目前鮮見有關于以雞腸粉作為飼料動物蛋白源并補充必需氨基酸應用到水產動物上的相關報道。

鯉（Cyprinus carpio）屬于雜食性魚類，是我國重要的淡水經濟養殖品種，在水產養殖中占有很大比重。據《2021中國漁業統計年鑒》統計，2020年我國鯉養殖產量達到289.67萬t，較2019年增加1.14萬t，增幅0.92%。本試驗基于鯉的營養基礎，在不添加魚粉的條件下，以雞腸粉作為飼料中主要動物蛋白源并補充賴氨酸和蛋氨酸，探究不同添加水平的限制性氨基酸對鯉生長、消化及蛋白質代謝相關理化指標的影響，以期為雞腸粉在淡水魚飼料中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計和管理 試驗所用的鯉購自遼寧省丹東市某養殖場，在4.3 m×1.5 m×1.2 m的水泥池中暫養2周以熟悉試驗環境，期間投喂對照組飼料。養殖試驗在大連海洋大學遼寧省北方魚類生物學及增養殖重點實驗室循環水池（4.3 m×3.0 m×1.4 m）進行，采用網箱進行養殖。選取初始體重為（55.54±0.2）g的鯉150尾隨機分為5組，每組3個重復，每個重復10尾，置于15個1.3 m×0.8 m×0.7 m的聚乙烯網箱中。養殖周期為8周（2021年6月19日~2021年8月14日），每日投喂2次（9：00和17：00）表觀飽食，每日吸底1次、換水1次，換水量約為1/5。試驗水體為曝氣24 h以上的自來水，試驗期間光照為自然光照，水體溫度為（27.0±1.0）℃，溶氧為（7.0±0.5）mg/L，pH為（7.6±0.5）。

1.2 試驗飼料 雞腸粉由遼寧省鞍山裕豐飼料有限公司提供，粗蛋白質65.47%，粗脂肪14.80%，其他試驗飼料原料均購自于大連當地市場。雞腸粉和魚粉營養水平及氨基酸含量見表1，以雞腸粉、豆粕等為主要蛋白源，豆油為主要脂肪源配制5組等氮等脂的飼料，標記為G1、G2、G3、G4、G5（表2）。參考鯉的營養需求（美國科學院國家研究委員會，2015），依據蛋氨酸與賴氨酸比值為0.318，配制限制性氨基酸，限制性氨基酸（Met：Lys=0.318）添加量分別為0%（G1組、對照組）、0.5%（G2組）、1.0%（G3組）、1.5%（G4組）、2.0%（G5組）。飼料原料過60目篩，混合均勻后經制粒機制成2 mm的顆粒飼料，放入42℃烘箱中，烘干至水分含量為10%，放入自封袋中于-20℃冰箱中保存。

表1 雞腸粉和魚粉的營養水平及氨基酸組成 %

表2 試驗飼料組成及營養水平（干物質基礎） %

1.3 樣品采集及指標測定 試驗結束后，試驗魚停食24 h，使用50 mg/L的MS-222溶液麻醉，稱重測量體長、體重，計算肥滿度和生長指標。每個網箱取6尾魚，剝離內臟團和肝臟并稱重，用于計算臟體比和肝體比，并全部取肝臟、前中腸，同組混樣裝管，樣品保存于-80℃保存待測。每個網箱取4尾魚用注射器吸取肝素鈉靜脈采血，將采集到的血液樣本注入10 mL離心管中，于4℃條件下，5000 r/min離心10 min，取上清液保存于-80℃備用，用于血清生化指標分析。每個網箱隨機取2尾魚，剪下1 cm左右的中腸，使用生理鹽水洗凈后置于4%的多聚甲醛中固定，用于腸道組織切片的制作。腸道和肝臟樣品分別注入質量體積比1：9的生理鹽水，經4℃、4000 r/min、10 min高速離心后，取上清液，4℃保存，用于腸道消化酶、肝臟蛋白質代謝酶活性的測定。生長計算公式如下：

特定生長率/（%/d）=（ln終末體質量-ln初始體質量）/56×100；

增重率/%=（平均終末體質量-平均初始體質量）/平均初始體質量×100；

飼料系數=平均飼料攝入量/（終末平均體質量-初始平均體質量）；

肥滿度/（g/cm3）=終末體質量/體長3×100；

成活率/%=（終末個體數/初始個體數）×100；

臟體比/%=內臟團重/體質量×100；

肝體比/%=肝臟重/體質量×100。

1.3.1 飼料、雞腸粉和秘魯魚粉常規營養成分的測定 飼料中水分含量采用105℃烘箱烘干至恒重測定（GB/T6435-2006）；粗蛋白質含量采用凱氏定氮法測定（GB/T6432-2018）；粗脂肪含量采用索氏抽提法測定（GB/T6433-2006）；粗灰分采用馬弗爐550℃高溫灼燒法測定（GB/T6438-2007）。

1.3.2 飼料、雞腸粉和秘魯魚粉氨基酸測定 前處理參考國標法（GB 5009.124 2016），使用全自動氨基酸分析儀（L-8900型，日立制作所）測定。

1.3.3 腸道消化酶活性的測定 胃蛋白酶（PEP）、淀粉酶（AMS）和脂肪酶（LPS）均采用南京建成生物工程研究所試劑盒進行測定。

1.3.4 肝臟蛋白質代謝酶活性的測定 谷草轉氨酶（AST）和谷丙轉氨酶（ALT）采用南京建成生物工程研究所試劑盒進行測定。

1.3.5 血清生化指標的測定 總蛋白（TP）、總膽固醇（T-CHO）、甘油三酯（TG）、谷草轉氨酶（AST）和谷丙轉氨酶（ALT）均采用南京建成生物工程研究所試劑盒進行測定。

1.3.6 腸道切片 鯉中腸樣本使用多聚甲醛固定24 h，并使用一系列分級乙醇濃度脫水，然后使用標準石蠟包埋方法制備蘇木精-伊紅（HE）切片。采用顯微鏡進行觀察中腸組織切片，S-viewer軟件進行測量并拍照。每張切片取10個完整的絨毛高度（VH）、肌層厚度（MT）、絨毛寬度（VW），取平均值作為測定結果。

1.4 數據處理 試驗數據用“平均值±標準誤”表示，采用SPSS 25.0軟件（IBM，USA）進行單因素方差分析（one-way ANOVA），并用Duncan’s法進行多重比較來分析各處理組間的顯著性，設置P＜0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉生長性能的影響 由表3可知，無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉成活率無顯著影響（P>0.05）。G3、G4和G5組鯉的終末體質量、增重率和特定生長率均顯著高于對照組（P＜0.05）。G3、G4和G5組鯉的終末體質量較對照組分別上升12.01%、16.64%和17.04%（P＜0.05）；G3、G4和G5組鯉的增重率較對照組分別上升17.56%、24.18%和24.94%（P＜0.05）；G3、G4和G5組鯉的特定生長率較對照組分別上升9.95%、13.43%和13.93%（P＜0.05）。隨著限制性氨基酸補充水平的增加，鯉的臟體比和肝體比呈下降趨勢，G3、G4和G5組臟體比與對照組相比分別下降16.69%、27.35%和27.10%（P＜0.05），G4和G5組肝體比與對照組相比分別下降13.55%和16.13%（P＜0.05）。隨著限制性氨基酸補充水平的增加，鯉飼料系數呈下降趨勢，與對照組相比，G3、G4和G5組飼料系數分別下降5.06%（P>0.05）、8.23%（P＜0.05）和4.43%（P>0.05）。

表3 無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉生長性能的影響

2.2 無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉腸道消化酶活性的影響 由表4可知，無魚粉飼料中補充限制性氨基酸后鯉腸道胃蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性呈上升趨勢，G2組胃蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性與對照組差異不顯著（P>0.05），G3、G4、G5組胃蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性均顯著高于對照組（P＜0.05），并在G5組達到峰值。G3、G4、G5組胃蛋白酶活性較對照組分別上升61.07%、74.93%和164.57%（P＜0.05）；G3、G4、G5組淀粉酶活性較對照組分別上升55.56%、60.68%和71.79%（P＜0.05）；G3、G4、G5組脂肪酶活性較對照組分別上升90.55%、113.58%和124.61%（P＜0.05）。

表4 無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉腸道消化酶活性的影響

2.3 無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉腸道組織形態的影響 由表5可知，無魚粉飼料中補充限制性氨基酸后鯉腸道肌層厚度、絨毛高度、絨毛寬度呈上升趨勢，G2組肌層厚度、絨毛高度、絨毛寬度與對照組差異不顯著（P>0.05），G3、G4、G5組肌層厚度、絨毛高度、絨毛寬度均顯著高于對照組（P＜0.05），并在G5組達到峰值。G3、G4、G5組肌層厚度較對照組分別上升22.98%、29.13%和29.32%（P＜0.05）；G3、G4、G5組 絨 毛高度較對照組分別上升8.61%、13.33%和16.90%（P＜0.05）；G3、G4、G5組絨毛寬度較對照組分別上升27.09%、39.58%和51.28%（P＜0.05）。各組腸道切片見圖1。

圖1 無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉中腸組織形態的影響

表5 無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉腸道組織形態的影響 μm

2.4 無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉肝臟代謝酶活性的影響 由表6可知，無魚粉飼料中補充限制性氨基酸后鯉肝臟谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶活性均呈上升趨勢，G2組谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶活性與對照組差異不顯著（P>0.05），G3、G4、G5組谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶活性均顯著高于對照組（P＜0.05）。G3、G4、G5組谷草轉氨酶活性較對照組分別上升4.28%、5.34%和6.99%（P＜0.05）；G3、G4、G5組谷丙轉氨酶活性較對照組分別上升6.88%、9.12%和11.21%（P＜0.05）。

表6 無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉肝臟代謝酶活性的影響 U/mg prot

2.5 無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉血清生化指標的影響 由表7可知，鯉血清總蛋白水平呈上升趨勢，G2組總蛋白水平與對照組差異不顯著（P>0.05），G3、G4、G5組總蛋白水平較對照組分別上升0.21%、0.85%和0.95%（P＜0.05）。鯉血清總膽固醇、甘油三酯水平及谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶活性在各組間均無顯著差異（P>0.05）。

表7 無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉血清生化指標的影響

3 討論

3.1 無魚粉飼料中補充必需氨基酸對鯉生長性能的影響 賴氨酸和蛋氨酸作為必需氨基酸，通常被認作是水產動物的第一、第二限制性氨基酸，對于維持水產動物的生長和正常的生理代謝有著重要的作用（Machado，2020；李小軍，2019；Coutinho等，2017；劉夢梅，2016）。研究發現，在飼料中補充賴氨酸能夠不同程度地提升團頭魴（廖英杰等，2013）、勃氏雅羅魚 （牛小天等，2019）、雅 羅 魚（左 亞 男，2017）、草 魚（劉 夢 梅，2016）、克氏原螯蝦（張微微等，2013）和雜交石斑魚（Li等，2019）的增重率、飼料效率和蛋白效率。類似的，飼料中補充蛋氨酸也能夠改善大菱鲆（Gao等，2019）、軍曹魚（Chi等，2020）、尼羅羅非魚（Guo等，2020）和吉富羅非魚（向梟等，2014）的生長性能。相關研究也表明，在低魚粉或無魚粉飼料中補充賴氨酸和蛋氨酸能夠在一定程度上改善水產動物的生長性能和提高飼料效率（黃文文等，2015；Rawles等，2013；宋宏斌等，2011）。在本研究結果中，鯉的終末體重量、增重率、特定生長率隨必需氨基酸補充水平的增加呈先增加后趨于平穩的趨勢，G3、G4和G5組終末體重量、增重率、特定生長率均顯著高于對照組，說明雞腸粉飼料蛋白源添加必需氨基酸后能夠顯著提升鯉的生長性能。申斌（2014）研究發現，飼料中補充賴氨酸和蛋氨酸，能夠使飼料氨基酸組成趨于平衡，從而促進水產動物生長。馮勇軼等（2020）研究表明，飼料中補充適量的賴氨酸和蛋氨酸能夠改善珍珠龍膽石斑魚的生長性能，過量則會影響飼料氨基酸的合理組成從而降低飼料利用效果。張玲等（2021）研究結果也表明，飼料中添加賴氨酸和蛋氨酸較未添加能夠顯著提高鯉的生長性能，但進一步增加添加水平鯉生長性能未發生顯著改善，趨于平穩狀態，類似的情況也在麥氏托頭石首魚（Madrid等，2019）、團頭魴（宋長友等，2016）和斜帶石斑魚 （楊烜懿等，2020）中發生。在本研究結果中，無魚粉飼料中補充賴氨酸和蛋氨酸對鯉的肥滿度無顯著影響，但顯著降低了G3、G4和G5組鯉的臟體比和肝體比，說明雞腸粉飼料蛋白源補充賴氨酸和蛋氨酸后能夠促進內臟脂肪和糖原的轉化。這也與在團頭魴（廖英杰等，2013）、草魚（Jiang等，2016）和吉富羅非魚（向梟等，2014）上的研究結果相似，適宜的賴氨酸和蛋氨酸能夠降低魚體的臟體比和肝體比，促進脂肪和糖原向蛋白質的轉化。本試驗中，當飼料中必需氨基酸補充水平較低時，鯉生長速度較慢、飼料系數較高，隨著必需氨基酸補充水平的增加鯉增重率顯著增加，飼料系數顯著降低。吉富羅非魚（向梟等，2014）、雅羅魚（左亞男，2017）和勃氏雅羅魚（牛小天等，2019）上的研究也表明，飼料中添加適量的賴氨酸和蛋氨酸能夠降低飼料系數，提高飼料效率和蛋白質效率。

3.2 無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉腸道消化酶活性的影響 消化酶是由消化器官和消化系統分泌的一種具有高度的催化性和專一性的酶類，消化酶的活性直接說明了水產動物對其營養物質消化吸收的能力（唐黎等，2007）。相關研究表明，飼料中添加適量的賴氨酸和蛋氨酸，能夠在一定程度上提高水產的消化酶活性，促進營養物質的消化和吸收（張微微等，2013；王光花，2007；趙春蓉，2005）。李雪吟（2017）研究表明，飼料中添加適量的賴氨酸能夠影響草魚TOR和4E-BP基因的表達，調控消化酶基因的轉錄，提高魚類的消化酶活性。Li等（2014）研究結果表明，飼料中補充適量的賴氨酸能夠提高草魚腸道胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶活性，認為賴氨酸能夠刺激魚胰腺中消化酶的合成和促進消化酶的分泌及釋放。類似的，Noor等（2021）研究結果也表明，飼料中補充適宜的蛋氨酸能夠提高南亞野鯪的腸道消化酶活性，改善南亞野鯪的消化和吸收能力。與前人的研究結果相似，本研究結果中，無魚粉飼料中補充賴氨酸和蛋氨酸后鯉腸道胃蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性呈上升趨勢，G3、G4、G5組胃蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性顯著高于對照組，說明無魚粉飼料中補充適量的賴氨酸和蛋氨酸能夠提高鯉的消化酶活性，促進鯉腸道對營養物質的消化和吸收。

3.3 無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉腸道組織形態的影響 魚類的腸道是魚類消化和吸收的主要器官和場所，腸道肌層厚度、絨毛高度、絨毛寬度是評價魚類腸道組織變化的重要指標（Li等，2019）。絨毛高度和絨毛寬度的增加通常被視為腸道營養物質吸收表面積的增加，肌層厚度的增加可以促進腸道的消化和吸收能力（Tan等，2018）。在本試驗中，鯉腸道肌層厚度、絨毛高度、絨毛寬度隨著賴氨酸和蛋氨酸添加水平的增加呈上升趨勢，G3、G4、G5組肌層厚度、絨毛高度、絨毛寬度顯著高于對照組，表明無魚粉飼料中補充適宜的賴氨酸和蛋氨酸能夠增加腸道營養物質吸收表面積和改善鯉腸道的消化功能。本試驗研究結果與李小軍（2019）和Gao等（2019）研究結果相似，飼料補充適量的賴氨酸和蛋氨酸能夠增加虎龍雜交斑和大菱鲆腸道肌層厚度、絨毛高度、絨毛寬度，改善腸道發育情況。

3.4 無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉肝臟代謝酶活性的影響AST和ALT是肝臟內參與氨基酸代謝的轉氨酶，是評價肝臟功能代謝健康最重要的指標之一，AST和ALT活性的高低反映出了魚類肝臟氨基酸和蛋白質代謝的狀態（段晶等，2019）。王香麗等（2015）研究表明，飼料中添加適量的蛋氨酸能夠提高瓦氏黃顙魚肝臟AST和ALT活性，增強機體氨基酸代謝能力。張新黨等（2021）使用缺乏蛋氨酸的飼料飼喂絲尾鳠發現，絲尾鳠肝臟AST和ALT活性異常，導致肝臟氨基酸代謝不平衡和蛋白質代謝紊亂。向梟等（2016）研究結果也表明，飼料中添加適量的蛋氨酸能夠增強羅非魚肝臟AST和ALT活性，促進羅非魚體內氨基酸的代謝和蛋白質的合成。劉夢梅（2016）研究表明，低蛋白飼料中補充賴氨酸和蛋氨酸能夠提高草魚肝臟AST活性，促進轉氨作用。與前人的研究結果相似，在本試驗結果中，無魚粉飼料中補充限制性氨基酸后鯉肝臟AST、ALT活 性 均 呈 上 升 趨 勢，G3、G4、G5組AST、ALT活性均顯著高于對照組，表明無魚粉飼料中補充適量的賴氨酸和蛋氨酸有利于機體正常的氨基酸代謝和蛋白質的合成。以上結果的出現，很可能是由于無魚粉飼料中補充適量的賴氨酸和蛋氨酸后，飼料中氨基酸的組成趨于平衡，增強了AST、ALT的轉氨作用，促進了機體對蛋白質的周期代謝（王香麗等，2015）。

3.5 無魚粉飼料中補充限制性氨基酸對鯉血清生化指標的影響 血清生化指標可以反映組織細胞通透性和機體生理代謝狀態，在一定程度上可以作為評價動物健康狀態的指標之一。血清總蛋白是在肝臟合成的，反映了機體蛋白質代謝和肝臟功能狀態，血清總蛋白含量增加可以促進機體蛋白質沉積，促進生長（陳曉瑛等，2019）。在本試驗結果中，鯉血清總蛋白水平呈上升趨勢，G3、G4、G5組總蛋白水平均顯著高于對照組，與鯉肝臟AST、ALT活性趨勢一致，表明無魚粉飼料中補充適量的賴氨酸和蛋氨酸能夠改善機體蛋白質代謝狀態，這一結果也與前人對草魚（劉夢梅，2016）、鳡（楊威，2012）、點帶石斑魚（Luo等，2016）和黑鯛（周凡，2011）的研究結果相似。甘油三酯和總膽固醇反映了機體脂肪代謝狀態（向梟等，2016）。在本試驗結果中，鯉血清甘油三酯和總膽固醇水平與對照組差異不顯著，表明飼料中補充適量的賴氨酸和蛋氨酸不會對鯉脂肪代謝產生有害影響。關于飼料中添加賴氨酸和蛋氨酸，對水產動物血清甘油三酯和總膽固醇水平變化的相關研究，結果并不相同。周凡（2011）研究表明，飼料中添加不同水平的賴氨酸后，黑鯛血清總膽固醇水平呈下降趨勢，甘油三酯水平無顯著變化。林郁蔥（2012）研究表明，胭脂魚血清總膽固醇和甘油三酯水平隨著飼料中蛋氨酸水平的增加而顯著增加。向梟等（2016）研究表明，羅非魚血清膽固醇和甘油三酯含量隨著飼料中蛋氨酸水平的增加呈先升高后穩定的變化趨勢。目前針對賴氨酸和蛋氨酸調節脂肪代謝機理的研究較少，以上結果的出現，很可能是由于品種、食性、規格、養殖環境、飼料配方及對賴氨酸和蛋氨酸利用能力的不同所導致的水產動物脂肪代謝水平的差異。正常情況下血清中AST、ALT活性很低，當肝臟受到損傷時才會釋放到血液之中導致活性顯著升高（陳晨等，2010）。在本試驗結果中，鯉血清AST、ALT活性均較低且無顯著變化，表明無魚粉飼料中補充適量的賴氨酸和蛋氨酸并不會對鯉肝臟造成損傷。研究發現，在飼料中蛋氨酸含量不足時瓦氏黃顙魚（王香麗等，2015）、建鯉（Feng等，2011）會出現蛋白質代謝異常，肝臟受損的情況。

4 結論

在本試驗條件下，無魚粉飼料中添加1.0%、1.5%和2.0%的限制性氨基酸均能夠顯著提高鯉的生長性能和消化酶活性，改善鯉腸道發育情況和肝臟蛋白質代謝狀態，并對鯉血清生化指標無有害影響，且以2.0%的添加量效果最好。