食品與飼料中致病微生物檢測技術及展望

武俠均

（唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心，河北 唐山 063000）

影響人類食品和動物飼料產品質量安全的因素有很多，其中致病微生物污染是最重要因素之一。致病微生物就是能夠導致人類和動物疾病的微生物，其可直接影響人類食品和動物飼料產品的質量與安全，進而危害人類和動物健康，給畜牧業生產造成重大損失，甚至引發公共安全事件。因此，飼料和食品中致病微生物的檢測技術很早就成為了人類研究的重要課題之一。

飼料和食品中致病微生物的檢測是在微生物鑒定學科基礎上發展起來的一門應用技術。隨著微生物學研究的不斷深入和新技術的應用，致病微生物檢測技術也得到了很好的發展。目前，在我國現行有效的飼料和食品檢測標準中，傳統方法和現代技術同時存在，但傳統方法占據主導地位，所有標準的仲裁方法都是采用的傳統經典方法。現代技術多在行業標準中出現，尤其在出入境標準中較多，盡顯其開放、快速、高效的行業特點，但陽性樣品的最終鑒定仍然要依賴傳統的鑒定方法。本文對現行有效的國家標準、行業標準和地方標準進行了分類歸納和總結，并提出了一些技術上的問題和思考，以期能夠對飼料和食品質量安全檢測工作，以及相關標準的制修訂工作有所裨益。

1 常見致病微生物及其危害

目前，飼料和食品質量安全監測中常見的致病微生物主要是腸道微生物，例如沙門氏菌、志賀氏菌、李斯特氏菌、大腸埃希氏菌、大腸菌群、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、霉菌等。

1.1 致病微生物的危害 飼料和食品中的致病微生物主要是引起腸道反應和中毒癥狀，影響畜牧業生產和人類生活，甚至危及動物和人類健康。以沙門氏菌為例，鼠傷寒沙門氏菌病在世界公共衛生學上是一類危害極大的人畜共患病；沙門氏菌屬腸桿菌科，感染后可導致人和動物中毒，引起胃腸炎、傷寒和副傷寒、敗血癥等，嚴重時可以造成人和動物死亡（蔣培紅，2007）。有資料顯示，沙門氏菌污染是美國食品中毒死亡的主要因素之一。全美每年報道約4萬人被感染致病，而實際患病人數可能超過報道人數的20倍（許多輕癥患者因未就醫，而未被統計）；據不完全統計，每年約有上千人死于沙門氏菌急性感染。

2.2 霉菌毒素的危害 許多微生物在生長和繁殖過程中會產生大量有毒物質，其中以霉菌毒素最為常見，而且危害最大。這類微生物主要包括曲霉菌屬、青霉菌屬和鐮刀菌屬等，其產生的毒素以黃曲霉毒素、嘔吐毒素、赭曲霉菌毒素、雪腐鐮刀菌烯酮、玉米赤霉烯酮較為多見。以黃曲霉毒素為例，黃曲霉毒素是由黃曲霉菌、寄生曲霉菌產生的次生代謝產物，其化學結構類似，是一類二氫呋喃香豆素衍生物，主要有B1、B2、G1、G2，以及兩種動物代謝產物M1、M2。黃曲霉毒素被世衛組織界定為一類致癌物質，其毒性是氰化鉀的10倍、砒霜的68倍，其毒害作用主要是對人類及動物的肝臟造成傷害，可引發肝炎、肝硬化、肝壞死等（馬建等，2012）。黃曲霉毒素B1也是飼料和食品污染中最為常見的毒素之一，其毒性和致癌作用也最強。據報道，20世紀60年代發生在英國的大量火雞突發性死亡事件，是由于使用了被黃曲霉毒素污染的花生粕造成的。花生和玉米籽實是最容易被黃曲霉毒素污染的飼料和食品加工原料。

2 致病微生物檢測技術現狀

目前，飼料和食品中致病微生物檢測技術分為傳統檢測技術和現代快速檢測技術兩大類。但無論是動物飼料，還是人類食品的檢測，國家標準和仲裁標準主要以傳統技術為主，現代技術應用較少，目前主要出現在行業標準和地方標準中。從現有的飼料和食品中致病微生物檢測技術來看，致病微生物的檢測大致分為兩大步驟，一是增菌與分離培養，二是分類鑒別與鑒定。

2.1 傳統檢測技術及其應用 傳統檢測技術是在細胞形態學和習性水平上，通過觀察微生物的細胞與菌落的形態、大小，及其生理特性、生化反應等特征對其進行微生物學分類鑒別的方法。現階段，在我國現行有效的飼料致病微生物檢測國家標準中飼料中霉菌總數、大腸菌群、細菌總數、志賀氏菌、沙門氏菌、產氣莢膜梭菌、副溶血性弧菌、單核細胞增生李斯特氏菌等檢測標準均采用的是傳統技術；現行有效的36個“食品安全國家標準《食品微生物學檢驗標準（GB 4789）》”中大多采用的也是傳統方法。

2.1.1 傳統經典檢測方法 經典的檢測方法其過程包括增菌和預增菌、分離培養、形態學觀察、生理/生化鑒別、血清學鑒別五個步驟。增菌和預增菌是使飼料或食品中的目標菌和因為貯存或加工而受傷的目標菌復壯和增殖的過程。分離培養是將待分離的目標菌通過一定的方式接種在適當的平板培養基上，使其細胞(或孢子)盡量分散，并長成一個個純種的單個菌落的過程。形態學觀察是通過肉眼觀察目標菌落的大小、形狀、光澤度、顏色和透明度等特性，或通過顯微鏡和染色技術觀察細菌的大小、形狀等特性，對其進行形態學鑒別。生理/生化鑒別是根據微生物對營養需要的不同，及其代謝產物的一些特定化學反應，通過觀察其生長狀況、化學反應產物，以及化學反應產生的顏色變化和現象，對其進行分類鑒定。血清學鑒別是根據微生物免疫學抗原/抗體特異性反應，對其進行分類、細分鑒定。經典方法的鑒定指標見表1。

表1 經典方法鑒定指標

2.1.2 傳統快速檢測系統 傳統的經典方法最繁瑣的工作是在生化鑒定和血清學鑒定環節。為了解決這個問題，市場上出現了許多簡單、快速、標準化的快速檢測產品。例如細菌用API系統、Enterotube系統和Biolog自動化或半自動化快速檢測系統等。

API細菌數值鑒定系統其代表產品為法國公司生產的API鑒定系統，該系統能鑒定700多種微生物；Enterotube快速鑒定系統（腸管系統）是由美國Roche公司生產的一類產品，與API鑒定系統類似;Biolog快速鑒定系統是由生化反應部分、檢測設備和計算機系統組成，可鑒定1140余種微生物，幾乎囊括了目前已知的所有人類致病菌，該系統由美國安普科技中心生產;全自動微生物分析系統(AMS)包括生化反應及微生物檢測系統和計算機分析系統，是一種運用概率最大近似模型技術對檢測數據進行分析的致病菌分類鑒定技術；Vitek-AMS自動微生物檢測系統是法國生物梅里埃集團公司生產的，目前是最先進、自動化程度最高的生物鑒定系統之一（周慶德，2005）。

2.2 現代快速檢測技術及其應用 近20年來,隨著基因組學、結構生物學、生物信息學、PCR技術和現代儀器分析技術的不斷發展與應用，微生物鑒別研究取得了突破性的進展，致病微生物的檢測技術也從細胞形態學水平發展到分子學水平。現代快速檢測技術是在分子學水平上應用現代科技手段，通過分析微生物細胞的組成成分、蛋白質結構、基因序列等遺傳物質對其進行分類鑒別的技術，其檢測過程主要包括增菌和預增菌（分離）、免疫或分子鑒定兩大步驟。

目前，采用現代快速檢測技術的飼料和食品檢測標準很多。為了便于大家了解，本文根據方法原理將這些技術分為以下四大類：免疫識別技術類、核苷酸測定技術類、核酸雜交技術類、細胞成分分析技術類。

2.2.1 免疫識別技術類 利用生物抗原-抗體特異性反應的原理，使試樣中的目標菌抗原與抗體結合形成抗原與抗體的復合物，再通過化學染色技術或生化反應等方式，達到對致病微生物進行分類鑒定的目的。

2.2.1.1 免疫反應色譜法 目標菌抗原與濾紙或硝酸纖維素濾膜上經過標記的抗體進行特異性結合，形成抗原-抗體復合物，復合物在毛細管作用下沿濾膜移動，當遇到被固定在濾膜上樣品檢測區的特異性抗體后被截留集聚下來，形成一條色帶，據此來判斷是否存在目標菌抗原。在免疫反應色譜法中常見的抗體標記技術有化學發光劑法和膠體金法。DB34/T 816-2008是應用免疫色譜技術制定的檢測飼料中沙門氏菌的地方標準，該標準方法對配合飼料和單一飼料的檢出限達到了25 g飼料中1個沙門氏菌的水平；SN/T 0184.4-2010是應用膠體金標記技術建立的食品中李斯特氏菌的檢測方法標準，其檢測靈敏度達到1×106CFU/mL。

2.2.1.2 酶聯免疫法 將目標抗原抗體（一抗）包被在固相容器內，加入目標菌抗原，使之與抗體（一抗）結合形成抗原抗體復合物Ⅰ，洗掉未結合的其他物質；加入特異性酶標抗體（二抗），使之與抗原復合物Ⅰ結合形成新的抗原抗體復合物Ⅱ，再次洗滌去除其他成分，加入特定反應底物與抗原抗體復合物Ⅱ反應生成熒光化合物或有色化合物；然后檢測其熒光強度或吸收度，通過與參照值進行比較，得到檢測結果。雷風等（2005）將抗體固定在硝酸纖維素薄膜上,制定了飼料中沙門氏菌斑點酶聯免疫吸附檢測方法,其沙門氏菌最低檢出限為400個/mL；對100份飼料進行方法比對試驗檢測，沙門氏菌陽性檢出率為43%，與常規方法38%無顯著差異；伍燕華等（2014）以福爾馬林滅活的鼠傷寒沙門氏菌制備抗沙門氏菌多克隆抗體建立了沙門氏菌雙抗ELISA檢測方法，可以檢測五種典型的沙門氏菌；并在其他雜菌存在的情況下，具有較好的靈敏性和特異性；純培養液的最低檢測限為1×104CFU/mL。

2.2.1.3 免疫磁珠法 免疫磁珠技術是丹麥學者1977年提出的，利用外層包裹著單克隆抗體（McAb）的磁性微珠（直徑1～2 μm）與溶液中相應的生物大分子進行特異性結合，用磁鐵收集磁珠，把目標大分子或細菌（蛋白質、多糖、DNA、RNA）從樣品中快速分離出來，然后再利用生化和血清學反應、熒光技術或生物發光技術進行鑒別分類。SN/T 1059.5-2006用包被了大腸桿菌（E.coli）O157抗體的免疫磁珠分離富集目標菌，通過選擇性培養和生化反應產生的顏色變化判定目標菌的存在。王壯等（2014）將空腸彎曲菌特異性多表位人工多肽抗體包被在磁性微珠上，制成的免疫磁珠排除了非空腸彎曲菌（包括其他彎曲菌）的干擾，對空腸彎曲菌具有較好的特異性；2 mg免疫磁珠在1mL濃度為2.5×103CFU/mL的空腸彎曲菌菌液中富集并培養出100～300 CFU的目標菌落，具有較好的敏感性。寇曉晶等（2019）利用免疫磁珠富集技術和ATP發光技術相結合建立的快速檢測3種常見食源性致病菌金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌的新方法，在明顯縮短預增菌時間的情況下，利用免疫磁珠的富集作用，取得了與傳統增菌方式相同的檢測結果。

2.2.1.4 量子點免疫熒光法 量子點又稱納米晶，是由Ⅱ-Ⅵ族元素制成的納米級微粒，其粒徑為1～10 nm。由于電子和空穴被量子限域，連續的能帶結構變成了具有分子特性的分立能級結構，受到激發后可發射熒光。

量子點免疫熒光法是一種量子點免疫熒光組織化學技術（QD-IHC），又稱量子點免疫熒光細胞化學，是根據抗原-抗體特異性結合的原理，用量子點標記特異性抗體作為探針，檢測微生物細胞中抗原性物質的一種新技術。量子點免疫熒光組織化學技術主要有直接法和間接法，間接法因二抗的放大作用而具有更高的敏感性。薛峰和張睿（2013）利用量子點熒光標記技術將目標菌特異性抗體制成量子點標記抗體，增菌液用免疫磁珠富集目標菌株，富集的目標菌磁珠與量子點標記抗體進行特異性抗原抗體反應而結合在一起；在紫外光激發下通過熒光顯微鏡觀察結合物表面的熒光，以判定是否存在目標菌；并制定了出口食品中空腸彎曲菌檢測的行業標準。劉曉紅等（2011）將熒光量子點標記在炭疽芽孢桿菌抗原上，建立了利用熒光量子點標記-免疫分析技術測定炭疽芽孢桿菌的方法；運用該方法檢測炭疽芽孢桿菌，在1.0×102～1.0×106CFU/mL有良好的線性關系，而且與同屬其他桿菌混合檢測，具有良好的特異性。Wu和謝冰（2014）利用山羊抗大腸桿菌抗體和兔抗山羊抗體的特異性結合的特性，對大腸桿菌進行量子點標記，建立了用熒光量子點標記抗體作為探針檢測化學藥物中的大腸桿菌的方法；該方法對鹽酸氯米帕明藥物中大腸桿菌的檢測有良好的特異性和回收率,而且檢測用時不到4 h。

2.2.1.5 垂直膜過濾法 本方法是通過垂直過濾的方式，使試樣通過包被有目標菌抗體的濾膜，其中的目標菌抗原與濾膜上的特異性抗體結合成抗原抗體復合物，通過酶偶合反應將抗原抗體復合物顯色，達到定性鑒別的目的。SN/T 1059.6-2016是將沙門氏菌抗體包被到濾膜上，用于富集檢測食品中沙門氏菌的食品進出口行業標準。曹春梅等（2005）利用針對含有O9抗原沙門氏菌的單抗3-47-0和膠體金標記的羊抗鼠IgG抗體，以微孔濾膜作載體，建立了一種用于臨床醫學檢測含有O9抗原沙門氏菌的斑點金滲濾方法；該方法適用于目前已知的含有O9抗原的所有沙門氏菌的檢測，且不受其他沙門氏菌、腸桿菌科和常見革蘭氏陽性菌的干擾，特異性較強；腸炎沙門氏菌的檢測限為6×104CFU/斑點，且用時不到10 min。

2.2.2 核苷酸測定技術類 利用酶鏈式反應PCR技術和DNA限制酶的酶切功能，將目標菌的DNA切割成大小、長短不等的核苷酸片段，通過瓊脂糖電泳或其他儀器設備對其進行基因序列分析測定，然后再通過與陽性樣品或基因圖譜數據庫進行比較，從而對致病微生物進行分類鑒定。

2.2.2.1 單菌種聚合酶鏈式反應（PCR）法 樣品經過預增菌和選擇性增菌處理后，其中的目標菌抗原在沸水浴條件下，菌體細胞破裂釋放出基因組DNA，離心使細胞壁等有形成分沉淀，以上清液為模板進行PCR擴增，擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。GB/T 28642-2012是利用聚合酶鏈式反應技術建立的飼料中沙門氏菌快速檢測的國家標準。 白艷艷等（2008）使用產單核細胞李斯特氏菌hlyA基因設計引物,進行PCR擴增，建立了食品中產單核細胞李斯特氏菌PCR檢測方法；該方法的檢測限為1×104CFU/mL，人工添加樣品的檢出限可提高到8 CFU/25 g。

2.2.2.2 多菌種聚合酶鏈式反應PCR法 樣品經過預增菌培養后，增菌液進行沸水浴多目標菌DNA提取，根據多個目標菌分別設計的多對引物，在同一條件下進行DNA擴增；然后用瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行分離測定。SN/T 1869-2007是利用多聚合酶鏈式反應技術快速檢測食品中沙門氏菌、志賀氏菌等9種致病菌的出入境行業標準。蔡亦紅和姚余有（2007）使用腸毒性大腸埃希氏菌的LTB、傷寒沙門氏菌的invA和志賀氏菌ipaH編碼基因設計出三對不同的引物，建立了3種食源性致病菌多重PCR快速檢測方法；檢測其靈敏度分別為腸毒性大腸埃希氏菌145 pg/mL、傷寒沙門氏菌100 ng/mL、志賀氏菌7 ng/mL。

2.2.2.3 細菌分子分型MLST法 該方法是在核酸測序的基礎上進行細菌分型鑒定的分子生物學分析技術，目前發展很快，生物分辨力極高。主要是通過PCR擴增和測序，對450 bp左右的多個管家基因核心片段序列進行分析，比較等位基因的序列類型，從而達到細菌分類鑒定的目的。所謂管家基因，即所有細胞中均要穩定表達的一類基因，其產物是維持細胞生命活動所必需的，其基因序列高度保守，且在大多數情況下持續表達，又稱看家或持家基因。

SN/T 4525.1-2016是出口食品中沙門氏菌的分子分型MLST測定行業標準。該標準根據沙門氏菌470 bp的7個管家基因核心片段的核酸序列設計擴增和測序引物，通過對管家基因片段的擴增和DNA雙向測序，得到完整的等位基因序列，將測序結果與MLST數據庫進行比對，從而對沙門氏菌進行分子分型鑒定。劉祥等（2015）使用細菌分子分型MLST技術對從畜禽新鮮肉類和副產品腸中分離出來的30株艾伯特埃希菌進行分析測定，通過DNASTAR軟件分析和MLST網站數據庫比對，發現了艾伯特埃希菌菌株。

2.2.2.4 細菌分子分型SPA基因分型法SPA即葡萄球菌A蛋白，是存在于葡萄球菌細胞壁的一種表面蛋白，是一種單鏈多肽，具有特異性，絕大多數金黃色葡萄球菌含有SPA。SPA基因的X區含有2～15個長度為21～27 bp的重復序列，由于重復序列數目、特征及排列順序不同而具有高度的多態性，并且具有重復性好和體內外穩定的特點。根據SPA基因序列設計引物對X區進行擴增，將擴增產物的測序結果與SPA基因分型數據庫進行比對分析，從而達到分型鑒定的目的。SN/T 4453-2016進出口行業標準就是根據金黃色葡萄球菌SPA基因序列的特性，采用SPA基因分型技術建立的食品中金黃色葡萄球菌的分子分型SPA基因分型測定的方法標準。李克誠等（2012）采用SPA基因分型技術對浙江省瑞安地區采集的100株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的SPA基因分型進行分析測定，通過與數據庫比對發現瑞安地區MRSA的SPA分型以t030和t437為主,并發現了新型菌種t10149。

2.2.2.5 聚合酶鏈式反應與離子對反相色譜（PCR-DHLC）法PCR-DHLC分析技術是將聚合酶鏈式反應技術和反相離子色譜儀相結合對DNA核酸片段進行分離檢測的方法。核酸片段分子中帶負電荷的磷酸根與離子對緩沖溶液TEAA分子中帶正電荷的氨基互相吸引，緩沖溶液TEAA分子中的三乙基與分析柱中C18表面的烷基相互吸引，用乙腈進行梯度洗脫，使大小不同的核苷酸片段分離；通過樣品吸收峰與陽性對照吸收峰比較，從而達到細菌鑒別的目的。

SN/T 2641-2010出入境行業標準就是利用PCR擴增技術和DNA限制酶切技術，將目標菌DNA切割成大小不等的核苷酸片段，再用DHPLC進行色譜分離，達到了檢測食品中沙門氏菌、志賀氏菌等30多種致病菌的目的。陳茹等（2012）建立的多重PCR-DHPLC檢測方法能在11種分枝桿菌和23種常見菌中準確鑒別出結核分枝桿菌和牛分枝桿菌，并且具有良好的特異性和靈敏度，檢測靈敏度分別為102～103bp和3.6～6.8 fg DNA模板濃度，而且檢測時間縮短至1 d。

2.2.2.6 環介導恒溫擴增（LAMP）法LAMP法是2000年由日本學者提出的，其針對目標基因的6個區域設計4種特異引物，在60～65℃恒溫條件和鏈置換DNA聚合酶作用下，進行核酸擴增，15～60 min內可以達到109～1010倍的擴增效果，而且操作簡單、特異性強。在合成DNA時，從脫氧核糖核苷三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg2+反應，產生大量白色焦磷酸鎂沉淀，不需要儀器設備，肉眼就能判定檢測結果。

SN/T 2754.4-2011就是利用環介導恒溫核酸擴增技術，根據單核細胞增生李斯特氏菌的特異靶序列virR基因設計兩對特殊內外引物，特異性的識別靶序列上6個獨立區域的原理，制定的出口食品中單核細胞增生李斯特氏菌檢測行業標準。王福厚等（2011）建立的沙門氏菌環介導等溫擴增（LAMP）檢測方法，DNA恒溫擴增最佳溫度為63℃，對沙門氏菌具有良好的特異性，檢測限為7～8 CFU／mL，時間短且操作簡便。 梅玲玲等（2011）利用其建立的志賀氏菌環介導恒溫核酸擴增(LAMP)快速檢測方法，對32株不同來源和血清型的志賀氏菌進行測定，結果均為陽性，檢測沙門氏菌、大腸桿菌等139株非志賀氏菌株檢測結果均為陰性；50批食品的檢測結果與傳統方法、實時熒光PCR方法結果比較差異不顯著；60℃擴增1 h，志賀氏菌的檢出限為200 CFU/mL，增菌培養8 h后提高至20 CFU/mL。

環介導等溫擴增方法優點：靈敏度高(比傳統的PCR方法高2～5個數量級)，反應時間短(30～60 min就能完成反應)，不需要特殊的儀器，操作簡單。缺點：操作過程容易形成氣溶膠污染，假陽性問題比較嚴重，引物設計要求比較高，有些基因不適合此法擴增。

2.2.3 核酸雜交技術類 來源不同的雙鏈DNA在體外經加熱處理后，解鏈變性為單鏈核苷酸，將它們在適當條件下混合在一起，經過退火處理，當兩條來源不同，并且存在互補或部分互補的堿基序列的單鏈核苷酸相遇時，按照堿基互補配對的原則，就可能復性形成新的雜合體DNA。通過測定雜合體DNA分子中的雜交百分率，就能判定兩個物種之間親緣關系的疏密程度，從而達到定性鑒別的目的。

2.2.3.1 實時熒光PCR方法 該方法是在DNA擴增反應體系中加入熒光化學物質，隨著擴增循環的增加，擴增產物以指數形式增長，熒光信號不斷增強，利用熒光信號的累積作用實時監控整個DNA擴增過程，并根據測定的擴增產物增長曲線的形狀和熒光強度進行待測菌的判定。

SN/T 2425-2010是進出口食品中霍亂弧菌快速檢測和鑒定的行業標準。該標準采用熒光探針（Taq Man）技術，根據霍亂弧菌溶血素基因、編碼O抗原的rfb基因，分別設計了三對各自僅在霍亂弧菌的溶血素基因、rfb基因間保守的特異性引物和三條特異性的熒光雙標記探針，實現了對食品中霍亂弧菌的檢測和鑒定。張娜娜等（2019）運用其建立的實時熒光定量PCR檢測技術，對市場出售的乳酸飲料樣品進行嗜酸乳桿菌檢測，結果有較好的特異性，絕對靈敏度3 pg，相對靈敏度103CFU/mL。

2.2.3.2 基因芯片法 核酸探針按照有序的行列格式點制在固相支持物上，通過特定溫度下與相應樣品進行雜交而用于樣品中核酸種類定性分析。以試樣增菌液提取的DNA作為模板進行多重PCR擴增，擴增產物與載有目標菌核酸探針的基因芯片進行雜交，雜交后用掃描儀對的芯片進行掃描，通過信號值計算結果進行判定。

SN/T 2651-2010出入境行業標準就是利用基因芯片技術，針對沙門氏菌單核細胞增生李斯特氏菌、空腸彎曲桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌（O157：H7）5種目標菌的保守基因核酸片段設計引物，實現了檢測肉及肉制品中沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、空腸彎曲桿菌和大腸桿菌（O157：H7）的目的。祝儒剛等（2012）利用多重聚合酶鏈式反應與基因芯片技術對肉及肉制品中金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、志賀氏菌、沙門氏菌和單核細胞增生李斯特菌等致病菌進行檢測，其建立的基因芯片檢測方法可以同時檢測上述5種致病菌，且具有良好的特異性，檢測限2 pg。陳昱等（2009）應用多重PCR和基因芯片技術對認為污染食品樣品中的志賀氏菌、沙門氏菌、大腸桿菌（O157）進行檢測，同時與傳統方法進行比對，結果與傳統方法一致，檢測限為50 CFU/mL，且特異性強，4~5 h內可以完成檢測。

2.2.3.3 微滴數字PCR法 試樣溶液經過微滴化處理,形成成千上萬個納升級的微滴反應體系，每個反應體系或含或不含待測的核酸靶分子；經PCR擴增、特異性探針雜交后，逐個對微滴進行檢測，檢測到熒光信號的微滴設為1，為測到熒光信號的設為0，根據泊松分布原理以及陽性微滴的個數與比例就能得到靶分子的起始拷貝數或濃度，從而對目標菌進行測定。

趙新等（2017）利用其建立的沙門氏菌微滴數字PCR的快速定量檢測方法與傳統國標培養法進行比對試驗，結果與傳統方法一致，具有較好的特異性，檢測 限為1×102CFU/mL。董蓮華等（2015）利用其建立的微滴數字PCR檢測方法，對豬肉、牛肉、雞肉樣品中的大腸桿菌（O157∶H7）進行檢測，O157∶H7基因組DNA反應液濃度在4～1.25×105bp/20 μL內線性最佳，方法的定量限為4 bp/20 μL，檢出限為3 bp/20 μL，而且具有良好的特異性。

2.2.4 細胞成分分析技術類 細胞成分分析主要是通過現代化學分析技術氣相色譜、液相色譜、質譜等分析儀器設備對微生物細胞表面特征性蛋白質進行分析，從而對致病微生物進行鑒別的技術。

基質輔助激光解析離子化飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）法是細菌全細胞的快速檢測技術，主要依據細菌表面特征性蛋白的分子量信息，對細菌進行分類鑒定。將分離的目標菌菌落試樣與適量的基質溶液加載在樣品板上，使溶劑揮發，形成試樣與基質的共結晶，利用激光輻射共結晶，基質分子吸收能量與樣品解吸附，并使樣品電離成離子態，通過飛行時間檢測器，將不同質荷比的離子分開，形成細菌特異性的質譜圖。將待測目標菌質譜圖在細菌標準蛋白質指紋質譜數據庫中進行查找和比較，從而確定細菌的種屬，達到微生物鑒定的目的。

SN/T 3872-2014是利用MALDI-TOF MS技術制定出口食品中沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌四種致病菌快速檢測的行業標準。王衛萍等（2015）利用MALDITOF MS方法對臨床標本中分離出來的1061株非重復細菌進行測序分析，并與Vitek 2 Compact全自動細菌鑒定系統的鑒定結果進行比較，結果有99.7%的菌株鑒定到屬，95.8%的菌株鑒定到種，只有0.3%的菌株未能給出鑒定結果。

3 存在的問題與未來展望

目前，傳統方法和現代技術在現行標準中同時并存，傳統的鑒別技術具有不可替代的地位，現代技術顯示了其簡便、快捷、高效的優勢。二者同時存在各自的不足，有待進一步發展和完善。

3.1 傳統檢測方法的缺點 傳統檢測技術的缺點是操作繁瑣復雜、耗時較長、效率低，批量檢測受到限制，不符合現代化大生產和現代生活快節奏的要求。以沙門氏菌檢測為例，按照傳統國標方法檢測，試驗需要準備13種培養基，并需制成各種平板、斜面、試管等，需要各種試劑30多種，準備這些試驗材料時間至少要花費2個工作日；試驗過程增菌、分離、生化培養操作時間大約130 h，相當于6 d的時間；生化試驗10個，血清學試驗3個，各種操作、觀察累計也要2個工作日；這樣一個樣品檢測需要至少10 d，并且需要連續工作才能完成（GB/T 13091-2018）。同時，試驗對檢測人員的素質和技術水平要求很高，需要豐富的實踐經驗，普通檢測人員難以勝任。

3.2 現代快速檢測技術的問題和思考 現代快速檢測技術的最大不足是對陽性結果不能做出準確判定，需要用傳統方法進行確認，不能滿足快速檢測的需要。免疫識別技術和核酸測定技術一般只能進行單個樣品和單個菌株的檢測。適用于生產單一產品企業的產品質量控制，但對于檢驗檢測機構的多菌種、大批量檢測和快速檢測，明顯不能滿足需要。在目前的現代檢測技術中，預增菌和選擇性增菌是致病微生物檢測不可逾越的重要步驟，也是制約檢測時效的關鍵瓶頸。一般增菌培養時間在18～24 h，甚至48 h或更長。在免疫識別技術中，抗原-抗體反應還有一種捕獲和富集目標菌的作用。通過增加稱樣量，擴大試料中致病微生物的數量,利用免疫磁珠或濾膜技術捕獲和富集目標菌，替代傳統的預增菌和選擇性增菌過程，突破增菌培養的時間限制還需進一步研究。

3.3 未來展望 利用核酸雜交技術、基因芯片技術實現多菌種、大通量檢測，充分利用基因技術提高傳統微生物鑒別速度和效率，利用免疫捕獲和富集技術突破現有增菌培養基的時間限制，實現快速、準確、高效的檢測目標。 芯片生物傳感器技術也是飼料和食品中的致病菌檢測研究的方向之一。通過研究和技術革新，提高生物傳感器的選擇性、生物響應的穩定性，以及信號檢測器和轉換器的使用壽命，并使之與計算機技術緊密結合，形成檢測、數據采集與處理自動化，進一步提高檢測工作效率。基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)微生物鑒定技術和基因測序技術有可能突破傳統鑒定方法的束縛，成為今后飼料和食品中致病微生物檢測技術研究發展的方向。由于現代快速檢測技術的不斷應用，為了適應新形勢的需要，應盡快建立國家細菌鑒定指紋質譜圖數據庫、分子分型數據庫、基因序列圖譜數據庫等，以滿足目前新技術發展的需要。