豬戊型肝炎的診斷技術研究

謝春芳 周佳明 于瑞嵩 董世娟 陳冰清 李震*

（1上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海 201106；2上海市農業遺傳育種重點實驗室動物遺傳工程研究室，上海 201106；3上海市金山區動物疫病預防控制中心，上海 201500）

戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus，HEV）是引起急性肝炎的病原之一，在全球范圍內廣泛傳播流行，其宿主范圍眾多，可在人類、家畜、家禽、寵物和各種野生動物中感染并跨種傳播、蔓延擴散，易造成戊型肝炎的爆發和散發[1]。其中，人源和豬源的HEV的基因同源性較高，故HEV可在人群和豬群中自由傳播而不受物種屏障制約[2-5]。

我國是豬戊型肝炎和人戊型肝炎的高發流行區，例如，在新疆南部爆發的一次豬戊型肝炎，導致當地豬戊型肝炎抗體陽性率高達80%以上，致使700多人死亡、12萬人感染[6-7]。因此，清除豬戊型肝炎，對于我國維持一個健康安全的養殖環境和人畜和諧相處的公共環境是非常關鍵和必要的。但是，如何建立一個兼具特異性、敏感性和穩定性的豬HEV檢測診斷方法，目前還沒有一個比較統一的標準，且如何區分豬戊型肝炎是急性還是慢性，對凈化豬場HEV有非常重要的意義。感染急性戊型肝炎的普通豬大概率可以自愈，并可清除自身體內的HEV；而感染慢性戊型肝炎的病豬則不同，由于病豬的免疫能力受損，HEV會長期存在于病豬體內，無法被完全清除，從而成為一個長期的傳染源。在此背景下，筆者通過查閱相關文獻，擬對豬戊型肝炎的臨床癥狀、實驗室檢測方法、診斷及評估方法等進行總結介紹，以期為建立一個準確快速的豬戊型肝炎檢測診斷標準提供理論依據。

1 豬戊型肝炎的臨床癥狀

豬感染戊型肝炎的臨床癥狀與人感染戊型肝炎的臨床癥狀類似，但是，普通豬感染HEV后通常不表現出典型的臨床癥狀。其中，急性戊型肝炎病豬表現出發燒、腹瀉、黃疸、病毒血癥，肝組織表現出局灶性或散在性壞死，肝細胞變性，肝小葉中央靜脈淤血，肝小葉間或肝小葉內淋巴細胞浸潤等；免疫功能低下或合并感染其他病毒的病豬，還會出現慢性HEV感染和肝外疾病，且肝組織會纖維化，最終發展為肝硬化和急性重度肝衰竭[8-10]。

值得注意的是，豬HEV與其他肝炎病毒共同感染引起的病豬臨床癥狀有的與豬急性戊型肝炎相似，故病豬的臨床癥狀只能作為參考，不能作為診斷依據，要準確判斷豬戊型肝炎還需依靠實驗室檢測。

2 豬HEV的實驗室檢測

2.1 豬HEV抗體檢測

目前，酶聯免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）因檢測方法簡單、靈敏、特異性強，可檢測血清或體液分泌物中許多病毒的抗原抗體，而被廣泛應用于血清學診斷研究。因此，ELISA是豬HEV抗體檢測的標準方法，也是主要方法之一，可分別檢測豬HEV特異性的中和抗體（主要是HEV-IgM和HEV-IgG）。一般來說，豬HEV ELISA抗體檢測試劑盒一天可檢測幾百份樣品，可迅速判斷被檢樣品中豬HEV-Ig G或豬HEV-IgM的檢測結果[11]。

其他可以用于檢測豬HEV抗體的方法還有免疫熒光檢測法（immunofluorescence assay, IFA）、免疫色譜分析法（又稱免疫親和層析技術，immunoaffinity chromatography）和高通量中和分析（high-throughput neutralization assay）。其中，高通量中和分析具有檢測快捷和結果準確的優勢，但因其所需儀器價格比較昂貴，目前在國內外并沒得到廣泛應用，在未來若儀器改進、價格下降，此方法將具有廣闊的發展前景[12]。

2.2 豬HEV病原檢測

既靈敏又準確地檢測豬HEV病原的方法就是檢測其病毒核酸RNA，其中，RT-PCR是常用且可靠的病毒核酸RNA檢測方法，既可用以檢測豬血清或糞便樣品中有無豬HEV核酸RNA，又可定性和定量分析，更可檢測出較低的豬H E V核酸RNA濃度（低至7 IU/mL）。一般來說，擴增引物通常選擇在豬HEV的ORF2基因保守區域，基因擴增采用巢式PCR，設計內外二對擴增引物，以提高檢測靈敏度[13-16]。檢測到豬HEV核酸RNA后，對結果為陽性的樣品，還需對擴增序列進行測序比對，以進一步驗證確認是否為豬HEV核酸RNA序列，且得到的基因序列還可進行基因分析，以追溯基因的起源及遺傳分化（HEV分為8個基因型，至少有36個基因亞型，這些不同基因型之間的差異原由、相互之間的交叉感染機理等，均有待進一步研究探索[17-18]）。

其他可用于檢測豬HEV病原的方法還有高通量分子測序技術、全自動核酸檢測系統、豬HEV抗體片段包的ELISA法、免疫印跡分析（Western blotting）和電鏡分析。其中，高通量分子測序技術是一種深度測序方法，對全基因組的測序能保留最原始的特性，具有高準確性、高靈敏度的優勢；全自動核酸檢測系統能自動完成從樣本處理到擴增、檢測的一系列操作步驟，可用于特定HEV核酸分子的檢測與分析[19]，但目前此方法還沒有被廣泛應用。

2.3 豬ALT水平檢測

丙氨酸轉氨酶（alanine transaminase，ALT）是檢測肝功能的重要指標之一。健康豬的ALT水平在（33±3）U/L，豬感染HEV后血清中的ALT水平會略微升高，故ALT水平可作為豬HEV的輔助檢測項目，也可作為肝功能的相關指標與流行病學史等一起用于綜合診斷[20-21]。

2.4 豬HEV實驗室檢測的注意事項

具體為：（1）避免豬HEV感染潛伏期的漏診。豬HEV感染潛伏期漏診是造成豬HEV檢測結果為假陰性的主要原因之一，故需開展周期性的重復檢測。（2）需對豬HEV核酸RNA進行測序分型。HEV只有1個血清型，但有8個基因型和許多亞基因型，不同動物對不同基因型HEV的易感性有所差別，故對豬H E V核酸R N A進行測序分型，有利于進行HEV的感染溯源追蹤和病毒演變分化研究。

3 豬戊型肝炎的診斷及評估

3.1 豬急性、慢性戊型肝炎的診斷

可通過RT-PCR檢測豬HEV核酸RNA，并結合豬HEVIgM和IgG抗體水平進行綜合判定。

在實驗室條件下，豬感染HEV后，最早于感染0.5周后在血液和糞便樣品中可檢測到豬HEV核酸RNA，于感染2周后在糞便中可檢測到豬HEV核酸RNA，于感染4周后在血清中可檢測到豬HEV核酸RNA，且感染3～6周后病原消失，故能檢測到豬HEV核酸RNA的主要為4月齡以下的豬，6月齡以上的豬在糞便和血清樣品中未見檢測到豬HEV核酸RNA的文獻報道，豬急性戊型肝炎轉為慢性戊型肝炎的病例也未見報道[22-23]。以上結果說明，豬急性戊型肝炎主要集中在4月齡以下的豬群中。同時，在實驗室條件下，豬感染HEV后，HEV抗體從感染后第2周開始出現，并會一直持續到第5周（但1月齡以下的仔豬檢測不出HEV抗體）。其中，HEVIgM抗體會很快降低到無法檢出，而HEVIgG抗體則會一直存在于血清中。因此，區分豬急性戊型肝炎和豬慢性戊型肝炎，除豬HEV核酸RNA的檢測結果外，還要結合豬HEV抗體的檢測結果進行綜合判定，單純的豬HEV核酸RNA檢測或單純的豬HEV抗體檢測，均可能導致誤判[24]。

具體來說，在同時檢測到豬HEV核酸RNA和HEVIgM抗體時，即可判定為豬急性戊型肝炎。而當豬HEVIgM抗體已降低至無法檢出時，即豬HEVIgM抗體檢測結果為陰性，豬HEVIgG抗體檢測結果為陽性[可長期（約2年）檢測到豬HEVIgG抗體[25]]，豬HEV核酸RNA檢測結果為陽性時，表明病豬的免疫系統已無法清除豬HEV病毒，即可判定為豬慢性戊型肝炎。

考慮到病毒潛伏期造成的漏診、誤診，需要進行多次重復檢測，以排除潛伏期的假陰性結果。

3.2 豬戊型肝炎診斷結果的評估

對豬戊型肝炎診斷結果的評估，可使用定量RT-PCR作為參考標準，通過計算總體一致性百分比、敏感性、特異性、陽性預測值（PPV）、陰性預測值（NPV）和Cohen’s kappa統計量，來評估每個分析的性能，并得出交叉表，從而進行診斷結果的評估。

4 小 結

豬戊型肝炎與人戊型肝炎的基因同源性非常高，豬HEV可跨種傳播感染人類，且豬HEV傳播感染到人類后，其毒力會大大增強[26]，從而給公共衛生安全帶來了極大隱患。另外，由于目前還沒有用于動物的HEV疫苗。因此，準確有效地診斷出豬戊型肝炎，盡快隔離、清除受豬HEV感染的病豬，避免其他健康豬受到豬HEV的感染就顯得尤為重要。這樣不僅可以保障養殖環境的健康安全，保證豬源性食物產品源頭的健康安全，也是切斷人感染戊型肝炎的關鍵措施之一。