長鏈非編碼RNA-Hexokinase 2 的生物信息學分析

魏 晨，蔣 振

（川北醫學院基礎醫學與法醫學院生物化學與分子生物學教研室，四川 南充 637000）

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）為長度超過200 個nt 的RNA 分子，盡管本身不編碼蛋白，但其在多種疾病的發生發展過程中發揮著調控作用。大量研究表明[1-3]，lncRNA 與腫瘤的發生發展、侵襲轉移、耐藥及預后密切相關。己糖激酶（HKs）是一個普遍存在的磷酸化酶家族，可啟動葡萄糖以供細胞內利用[4，5]。己糖激酶2 是該家族中最活躍的同工酶，主要在胰島素敏感組織中表達。己糖激酶是一種進化上保守的磷酸化六碳糖（己糖）的酶。磷酸化的葡萄糖（葡萄糖-6-磷酸）在糖酵解中、糖原合成、磷酸戊糖和己糖胺生物合成途徑，以及在ATP 合成、葡萄糖儲存和蛋白質糖基化中以及腫瘤的發生發展中起關鍵作用[6，7]。在哺乳動物中，已經鑒定了4 種HK 同工酶（HK1～4），并且最近鑒定了命名為HKDC1（含有己糖激酶結構域的蛋白1）的第5 種同工酶。HK1 在大多數組織中普遍存在并構成主要的HK 形式；HK2 廣泛存在，是胰島素敏感器官如心臟、骨骼肌和脂肪組織以及廣泛的腫瘤的主要同工酶。HK3 和HKDC1 表達有限，目前研究不多。HK4 具有在肝臟和胰腺β 細胞中高水平表達的單一催化部分，其分別控制糖原生成和胰島素分泌。與HK4 相反，所有其它HKs 具有2 個酶的催化口袋，但只有HK2 中兩種都起作用，而HK1、HK3 和HKDC1 僅在C-末端催化位點中具有活性[8，9]。上述研究表明，HK2 在多種器官的糖代謝及腫瘤的糖代謝中起著重要的作用，然而目前對于HK2 的研究多為針對單獨的靶點進行細胞內的實驗研究很少涉及對lncRNA-HK2 在細胞內功能的研究，這使得對lncRNA-HK2 的功能至今還不明確。為了全面闡明lncRNA-HK2 在細胞內的所調控的分子功能及生物學過程，本研究擬運用生物信息學分析方法，分析lncRNA-HK2 在細胞內的調控靶基因及信號通路，并對其進行生物學功能注釋，闡述lncRNA-HK2 在細胞內的功能作用和分子機制。

1 資料與方法

1.1 lncRNA-HK2 靶基因預測 經NCBI 基因數據庫查詢lncRNA-HK2 的序列，經miRDB 數據庫（http://www.mirdb.org/）和Starbase3.0 數據庫（https://starbase.sysu.edu.cn/index.php）預測與lncRNA-HK2 有miRNA-lncRNA 互作關系的miRNA，將miRDB 數據庫預測到的miRNA 與Starbase3.0 數據庫預測到的miRNA 取交集進行進一步分析。

1.2 miRNAs 靶基因預測 在Starbase3.0 數據庫中分別對這些miRNA 進行靶基因預測，選取預測程序個數為3，預測靶基因評分比較高的前5 個，通過DAVI 數據庫進行靶基因的GO 注釋和信號通路富集分析。

1.3 GO 注釋 從基因功能的3 個方面：細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物學過程（biological process，BP）進行分析，得到具有統計學意義的GO 注釋顯著性分析（P＜0.05），信號通路富集分析閾值取P≤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA-HK2 預測miRNAs 在miRDB 數據庫預測到的miRNAs 有15 個與lncRNA-HK2 有miRNA-lncRNA 互作關系的miRNA，在Starbase3.0 數據庫預測到有60 個，取兩者交集共有2 個miRNAs，其miRNA 序列見表1。

表1 長鏈非編碼RNA-HK2 預測的miRNAs

2.2 GO 注釋分析 lncRNA-HK2 通過hsa-miR-374a-5p 作用的靶基因主要調控蛋白磷酸化、腫瘤發生通路、轉錄調控、DNA 損傷反應、脂肪細胞分化及胚胎發育等基因及信號通路；分子功能主要與細胞的酶結合、翻譯抑制、泛素化結合、鈣離子結合等有關；lncRNA-HK2 通過hsa-miR-374b-5p 作用的靶基因主要調控基因表達、調控序列特異性DNA 結合轉錄因子的活性、翻譯調控、細胞對于胰島素的反應等；分子功能主要與蛋白激酶活性、轉錄抑制活性、DNA 結合、染色質結合、金屬離子結合及RNA聚合酶Ⅱ序列特異性DNA 轉錄因子結合等功能相關，見圖1。

2.3 信號通路富集分析 lncRNA-HK2 通過hsamiR-374a-5p 作用的靶基因主要調控干細胞的多能干性、腫瘤中的信號通路、TGF-beta 信號通路、糖蛋白信號通路，以及肺癌、結直腸癌、乳腺癌、胰腺癌及胃癌等多種腫瘤發展的信號通路；lncRNA-HK2 通過hsa-miR-374a-5p 作用的靶基因主要調控人乳頭狀病毒感染、甲狀旁腺激素合成、分泌及作用、MAPK 信號通路、TNF 信號通路、RAS 信號通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥信號通路、生長激素合成、分泌及作用與ErbB 信號通路等細胞內參與多種功能的信號通路，見圖2。

3 討論

HK2 是己糖激酶家族中最活躍的同工酶，主要在胰島素敏感組織中表達。大多數腫瘤細胞中的己糖激酶2 誘導有助于它們重新轉向有氧糖酵解。HK2可以停靠在線粒體上，在自噬調節和細胞死亡抑制方面發揮功能，這些功能獨立于其酶活性[10-13]。HK2水平和活性受許多轉錄、翻譯和翻譯后水平的因素調節。研究表明[14，15]，HK2 可以保護組織免受應激狀態的影響，并有助于組織的正常發育。它是由生長因子如TGF-β 等誘導的，這些生長因子影響轉錄因子c-MYC 的激活，進一步調控HK2 基因表達。FGF 信號傳導對血管形成很重要，內皮細胞和淋巴細胞中的HK2 降低可導致血液和淋巴血管缺陷，與FGF 受體（FGFR）-KO 小鼠相似。在成纖維細胞中，HK2 增強了TGF-β 的促纖維化作用，而HK2 基因敲除降低了TGF-β 刺激的纖維化過程[16-18]。這些結果說明，lncRNA-HK2 在細胞內也具有非常重要的功能。

本研究共得到2 個靶miRNAs，分別是miR-374a-5p 和miR-374b-5p。通過GO 功能注釋和Pathway 信號通路富集發現，lncRNA-HK2 通過hsa-miR-374a-5p 作用的靶基因主要調控蛋白磷酸化、腫瘤發生通路、轉錄調控、DNA 損傷反應、脂肪細胞分化及胚胎發育等基因及信號通路，這些結果說明其生物學功能主要與細胞內蛋白功能調節、轉錄調控、DNA 損傷修復及腫瘤發生發展等多種功能密切相關。另一方面，lncRNA-HK2 通過hsa-miR-374b-5p 作用的靶基因主要調控基因表達、調控序列特異性DNA 結合轉錄因子的活性、翻譯調控、細胞對于胰島素的反應、細胞粘附及細胞周期等生物學過程，進一步說明其廣泛參與調控細胞內的轉錄、翻譯及細胞周期等基本生理過程。而它們的分子功能主要與蛋白激酶活性、轉錄抑制活性、DNA 結合、染色質結合、金屬離子結合及RNA 聚合酶Ⅱ序列特異性DNA 轉錄因子結合等功能相關，說明其在細胞內與多種生物大分子結合并發揮作用。而lncRNAHK2 通過hsa-miR-374a-5p 作用的信號通路主要調控干細胞的多能干性、TGF-beta 信號通路、糖蛋白信號通路以及多種腫瘤發展的信號通路，表明其調控的功能主要與細胞生長，尤其是腫瘤性異常增生及其信號通路密切相關。此外通過hsa-miR-374a-5p 作用的信號通路主要調控甲狀旁腺激素合成、分泌及作用，生長激素合成、分泌及作用，MAPK信號通路，TNF 信號通路，RAS 信號通路等細胞內參與多種功能的信號通路，提示它們的功能主要與細胞內腫瘤等多種疾病和生物合成信號通路相關。

綜上所述，lncRNA-HK2 在細胞內調控的多個靶基因和信號通路，這些信號通路與多種疾病密切相關，lncRNA-HK2 可能作為有效的疾病診斷或治療靶點。