C1QA 在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達及臨床意義

林思彤，張鳳友，陳肖瑜，潘如冰

（廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，廣西 南寧 530021）

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其中80%～90%為肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），死亡率占全部惡性腫瘤死亡的13%，僅次于肺癌[1]。隨著腫瘤分子生物學(xué)技術(shù)水平的不斷發(fā)展，肝細(xì)胞癌的靶向治療正在快速發(fā)展。因此，深入探究肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵驅(qū)動基因及作用機制，尋找肝細(xì)胞癌診療的新靶點，具有重要的臨床意義。HCC發(fā)生發(fā)展過程是一個多步驟、多階段的過程，涉及眾多信號通路的傳導(dǎo)異常、效應(yīng)分子的異常表達及腫瘤的微環(huán)境因素[2]。近年來。C1q 等補體在各種人類腫瘤微環(huán)境中高度表達[3，4]，其在惡性腫瘤微環(huán)境中的調(diào)控作用日益受到關(guān)注。C1QA（complement component 1,q subcomponent，A chain，C1QA）是補體C1q 的其中一條子鏈，是先天性免疫及適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在補體系統(tǒng)經(jīng)典通路中起重要作用，其通過互補依賴或獨立的方式執(zhí)行多種免疫和非免疫功能，在腫瘤進展中發(fā)揮促進或抑制作用。但目前C1QA 在肝細(xì)胞癌中的表達水平和分子機制仍未完全闡明。基于此，本研究通過免疫組織化學(xué)染色及計算病理學(xué)方法，分析C1QA 基因在原發(fā)性肝細(xì)胞癌的表達及其相關(guān)基因，探討其與原發(fā)性肝細(xì)胞癌的臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性收集2018 年1 月-2022 年6月廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者腫瘤組織標(biāo)本65 份及對應(yīng)癌旁組織50 份。原發(fā)性細(xì)胞癌患者年齡40～79 歲，其中男57 例，女8 例，所有收集的病例均為我院手術(shù)治療的初診患者。排除合并其他腫瘤、經(jīng)放化治療患者。本研究經(jīng)過廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批，所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 Anti-C1QA 抗體（abcam 公司，EPR14634，1∶90 稀釋）及即用型快捷免疫組化MaxVisionTMHRP 試劑盒（鼠/兔，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。

1.3 免疫組織化學(xué)染色方法 肝組織石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片后，脫蠟至水，EDTA 堿性緩沖液高壓熱修復(fù)后，冷卻后0.3%H2O2室溫孵育15 min，PBS 液浸洗3 缸，各5 min，滴加Anti-C1QA 稀釋抗體后37 ℃中80 min，PBS 液浸洗3 缸，各5 min，滴加即用型二抗室溫孵育20 min，PBS 浸洗3 缸，各5 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，用中性樹膠封片。分別以腎組織作為陽性對照，以PBS 代替一抗作為陰性對照。

1.4 C1QA 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判讀 綜合評分=陽性細(xì)胞百分比×著色強度；C1QA 蛋白的陽性表達定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。腫瘤陽性細(xì)胞比例0 為0分，1%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，＞75%為4 分；著色強度：胞質(zhì)無著色為0 分，淺黃色為1 分，黃色為2 分，棕褐色為3 分。總分≤4分為低表達；＞4 分即為高表達。

1.5 評價方法 分析C1QA 蛋白表達在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達與臨床病理特征（性別、年齡、民族、腫物長徑、脈管癌栓、肝被膜侵犯、近癌旁肝內(nèi)微血管侵犯、微血管彌漫增生、Edmondson-Steiner 分級、衛(wèi)星灶情況、肝外轉(zhuǎn)移及HBV 感染）的關(guān)系。微血管彌漫增生：癌組織中微血管密度（microvessel density，MVD）＞50 條/HPF。在GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn）軟件的“Correlation Analysis”項目中，“GeneA”輸入“C1QA”，“GeneB”分別輸入“CD34、CCR2、CD40、CCL2”，“TCGA Tumor（Cancer name）”輸入“LIHC Tumor”，“Correlation Coefficient” 中選擇“Spearman”進行分析，分析C1QA 基因在肝癌中的表達與血管內(nèi)皮標(biāo)記物（CD34）及腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（CCR2、CD40、CCL2）的關(guān)系。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 24.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，計數(shù)資料采用（n，%）表示，比較采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法；相關(guān)性分析采用Spearman 分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 C1QA 蛋白在肝細(xì)胞癌組織與癌旁組織的表達比較 C1QA 蛋白在肝組織的表達主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色，見圖1。肝細(xì)胞癌組織中C1QA 蛋白高表達率為26.15%（17/65），高于癌旁組織的14.00%（7/50），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=2.528，P=0.112），見表1。

表1 C1QA 蛋白在肝細(xì)胞癌與癌旁組織中的表達（n）

2.2 C1QA 蛋白與肝細(xì)胞癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 C1QA 高表達與原發(fā)肝細(xì)胞癌微血管彌漫性分布及Edmondson-Steiner 分級密切相關(guān)（P＜0.05），與性別、年齡、民族、腫物長徑、脈管癌栓、肝被膜侵犯、近癌旁肝內(nèi)微血管侵犯、衛(wèi)星灶情況、肝外轉(zhuǎn)移及HBV 感染無關(guān)（P＞0.05），見表2。

表2 C1QA 蛋白與肝細(xì)胞癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系（n）

2.3 肝細(xì)胞癌中C1QA 基因與血管內(nèi)皮標(biāo)記物及腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的相關(guān)性 肝細(xì)胞癌中C1QA 的表達與血管內(nèi)皮標(biāo)記物CD34（r=0.24，P=3.5e-06）及腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞CCR2（r=0.56，P=6.5e-32）、CD40（r=0.24，P=2e-06）、CCL2（r=0.49，P=5.3e-24）均呈正相關(guān)，見圖2。

3 討論

C1QA 是C1 補體復(fù)合物的一個亞基，而C1 補體復(fù)合物由C1q、C1r 和C1s 三種蛋白質(zhì)組成。其主要功能除激活經(jīng)典補體途徑，參與消除微生物、免疫復(fù)合物等抗感染活動外，還參與補體激活無關(guān)的功能：各種免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)[5]，細(xì)胞遷移、黏附和分化[6]，凝血[7]，血管生成[8]及神經(jīng)突觸功能[9]。尤其是C1QA等補體通過與纖維連接蛋白（細(xì)胞間基質(zhì)的關(guān)鍵蛋白之一）相互作用促進細(xì)胞粘附，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的分離和遷移[10]。此外，C1QA 在腫瘤微環(huán)境中合成，腫瘤細(xì)胞激活C1QA 生成腫瘤相關(guān)抗原，導(dǎo)致補體激活片段在腫瘤表面沉積增加[11]、細(xì)胞外基質(zhì)重塑及調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，從而促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[12，13]。

目前研究表明[14，15]，C1QA 補體基因在不同腫瘤背景中呈差異性表達。在前列腺癌細(xì)胞中，C1QA 通過激活腫瘤抑制劑WOX1 誘導(dǎo)凋亡[16]。C1QA 通過對腫瘤微環(huán)境中的浸潤免疫細(xì)胞（如M1 巨噬細(xì)胞及CD8+T 細(xì)胞等）的影響，抑制了骨肉瘤的發(fā)展[17]。然而，在胰腺導(dǎo)管腺癌肝轉(zhuǎn)移中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的C1QA RNA 表達升高[18]，通過IL-6R/STAT3 信號通路上調(diào)CD59 來保護癌細(xì)胞免受補體依賴性細(xì)胞毒性的侵害，并有助于腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移[19]。C1QA基因可能參與了腫瘤免疫浸潤中CD8+T 細(xì)胞、Tregs和M2 巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)而促進食管癌的進展，其上調(diào)預(yù)測不良預(yù)后[20]。研究表明[21]，慢性肝炎肝臟中的C1q 確定為激活肝祖細(xì)胞和肝腫瘤中必需的β-連環(huán)蛋白途徑信號，并促進肝腫瘤的分化，并可能成為肝腫瘤的潛在治療靶點。MicroRNA miR-495 通過靶向C1q/腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白3 調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌的發(fā)展[22]。C1q 還能促進肝細(xì)胞腫瘤的進展的遷移和侵襲表型[23]。由此可見，C1QA 可能在腫瘤中發(fā)揮促進生存和誘導(dǎo)凋亡的雙重調(diào)控作用。C1QA 這種雙重特性的潛在機制可能由多種因素決定，如腫瘤細(xì)胞的類型、免疫基因的表達、浸潤免疫細(xì)胞的性質(zhì)、浸潤程度以及浸潤免疫細(xì)胞局部合成C1QA 的能力。

本研究發(fā)現(xiàn)，C1QA 蛋白在肝細(xì)胞癌組織中高表達率高于癌旁組織，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=2.528，P=0.112）。C1QA 在癌旁組織中表達，可能與宿主初級防御機制相關(guān)，當(dāng)正常肝組織感染病毒時，C1QA 與免疫復(fù)合物相互作用，殺死并消除病原體感染細(xì)胞，在肝組織中發(fā)揮保護作用[24]。然而在炎癥疾病后期，C1QA 可激活經(jīng)典補體通路加重疾病進展[25]。本研究結(jié)果顯示，C1QA 蛋白的表達與肝細(xì)胞癌中微血管彌漫增生有關(guān)，且其與血管內(nèi)皮標(biāo)記物CD34 具有正相關(guān)性，說明C1QA 基因可能通過促進血管生成進而促進肝細(xì)胞癌的發(fā)展。同時，腫瘤Edmondson-Steiner 分級越差，C1QA 高表達率越高，亦說明C1QA 蛋白的表達與腫瘤進展密切相關(guān)。通過GEPIA 在線工具進行相關(guān)分析顯示，在肝細(xì)胞癌中，C1QA 基因與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞正相關(guān)性，與Roumenina LT 等[26]觀點相符合，腫瘤細(xì)胞通過巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的補體C1q 而促進腫瘤生長；腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境、免疫抑制模式，促進血管生成、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移以及抵抗治療中發(fā)揮重要作用[21]，說明C1QA 可能由肝組織巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，并促進腫瘤生長。

綜上所述，C1QA 基因可能通過促進血管生成及與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞相互作用共同促進了原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)展，并可能為肝癌的靶向治療提供新思路。