mTOR、PTEN、Ki-67 蛋白表達水平變化與結腸癌病理學特征的相關性分析

張秀娟，黃麗娟

（新疆生產建設兵團第二師庫爾勒醫院病理科，新疆 庫爾勒 841000）

結腸癌（colon cancer）的病情進展導致患者整體生存預后的惡化，加劇患者無瘤生存時間和無進展生存時間的縮短[1，2]。腫瘤相關蛋白的表達改變能夠促進癌細胞在增殖、凋亡、分化等病理過程中的作用，影響癌細胞的生物學特征。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、Ki-67 蛋白表達濃度改變，能夠提高癌細胞DNA 核的持續性擴增的風險，導致癌細胞上游轉錄活性的增加，影響紡錘體的形成及分裂，提高染色體復制及擴增的速度[3，4]；張力蛋白同源蛋白（PTEN）是重要的細胞周期調控蛋白，其能夠在穩定癌細胞增殖速度的同時，抑制癌細胞持續性浸潤風險的增加[5]。部分研究揭示了mTOR、PTEN、Ki-67 蛋白在卵巢癌、甲狀腺癌等惡性腫瘤中的異常表達，認為異常表達的相關指標是促進惡性腫瘤患者臨床分期進展、導致治療預后惡化的重要因素[6]，但關于mTOR、PTEN、Ki-67 蛋白與結腸癌的臨床病理特征的關系研究不足。本研究選取90 例結腸癌組織標本，探討了相關指標的改變與結腸癌組織病理特征的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013 年3 月-2016 年6 月新疆生產建設兵團第二師庫爾勒醫院病理科90 例結腸癌組織標本（結腸癌組），45 例正常結腸組織（對照組）。結腸癌組男48 例，女42 例；年齡44～78 歲，平均年齡（57.72±13.21）歲；TNM 分期：Ⅰ期17 例，Ⅱ期24 例，Ⅲ期33 例，Ⅳ期16 例；發生淋巴結轉移40 例，分化程度：高分化20 例，中分化37 例，低分化33 例。對照組男25 例，女20 例；年齡40～73 歲，平均年齡（58.44±12.28）歲。兩組年齡、性別比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 納入排除標準

1.2.1 納入標準 ①結腸癌的診斷參考《外科學》第八版中的標準[7]；②結腸癌標本、正常結腸組織來源于我院病理科收集且經病理學檢查證實的標本；③患者年齡≤79 歲；④既往無放化療病史；⑤病案資料及相關檢查資料完整。

1.2.2 排除標準 ①轉移性結腸癌；②合并其他部位腫瘤的患者；③資料不完整，難以納入統計學分析。

1.3 方法 石蠟包埋，連續性切片厚度3 μm，60 ℃烤片60 min，常規脫水后，采用EDTA 進行抗原修復，加入10 μl 蒸餾水，加入10%過氧化氫5 il，室溫下孵育30 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次×3 min，加入mTOR、PTEN、Ki-67 蛋白的單克隆抗體（1∶1000 購自羅氏檢測公司），37 ℃孵育60 min，PBS洗滌3 次×3 min，加入HRP 標記的mTOR、PTEN、Ki-67 蛋白二抗（1∶2000 購自羅氏公司），37 ℃孵育20 min，PBS 洗滌3 次×3 min，加入DAB 后，PBS 沖洗和復染，脫水后在顯微鏡下進行觀察[8]。免疫組化結果判定[9]：mTOR、PTEN、Ki-67 蛋白的陽性著色表達于細胞質、細胞核，陽性染色為黃色或者更深。評分標準：①依據染色深淺：無色（0 分）、淡黃色（1分）、染色為棕黃色（2 分）、如果染色為褐色或者黑色（3 分）；②依據陽性細胞占比[10]：占比≤10%（1分）、占比11%～50%（2 分）、占比51%～75%（3 分）、占比＞75%（4 分）。染色深淺評分與陽性細胞占比評分之乘積總分＜3 分為陰性、≥3 分為陽性。

1.4 統計學方法 采用SPSS 16.0 進行數據分析，計量資料使用（）表示，比較采用t檢驗；計數資料使用（n）和（%）表示，比較采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 mTOR、PTEN、Ki-67 蛋白在結腸癌、正常結腸組織中的表達程度比較 結腸癌組mTOR 蛋白、Ki-67蛋白陽性表達率高于對照組，結腸癌組PTEN 蛋白陽性表達率低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 mTOR、PTEN、Ki-67 蛋白在結腸癌、正常結腸組織中的表達程度比較[n（%）]

2.2 mTOR、PTEN、Ki-67 蛋白表達與結腸癌組織病理特征的關系 不同TNM 分期、是否發生淋巴結轉移、不同腫瘤分化的結腸癌組織中mTOR 蛋白、PTEN 蛋白、Ki-67 蛋白陽性表達率分別比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 mTOR、PTEN、Ki-67 蛋白表達與結腸癌患者病理特征的關系（n，%）

3 討論

結腸癌的早期診斷水平較低，治療后的總體病情緩解率不高[11]。長期的臨床隨訪研究顯示，結腸癌的5 年生存率不足35%，手術治療或者聯合放化療等措施治療后的中位生存時間不足48 個月[12]。但迄今為止臨床上對于結腸癌患者的臨床預后及疾病早期診斷缺乏可靠的指標，影像學檢查能夠在診斷結腸癌過程中發揮重要的輔助價值，但其診斷的早期靈敏度較低，對于微小病變惡性腫瘤的發生風險的評估價值不足[13，14]。研究顯示[15]，血清學腫瘤相關指標的檢測，具有一定篩查價值，且對于特定類型惡性腫瘤的診斷具有重要的提示作用，能夠提高惡性腫瘤早期病變的診斷水平，并能夠在疾病的治療后動態隨訪等方面發揮作用。

本研究結果顯示，結腸癌組mTOR 蛋白、Ki-67蛋白陽性表達率高于對照組，結腸癌組PTEN 蛋白陽性表達率低于對照組（P＜0.05），表明mTOR 蛋白、Ki-67 蛋白、PTEN 蛋白在結腸癌組織及正常組織中的表達水平有明顯差異，可在結腸癌篩查中提供一定參考。分析原因為mTOR 對于局部環境中缺氧環境下線粒體的損傷、ATP 能量利用障礙，或者氧化自由基的傳遞障礙等過程均可發揮一定的作用；并且能夠影響腫瘤細胞DNA 的擴增速度，促進癌細胞核異型性增加，影響癌細胞內多種信號通路如MAPK 激活[16]。Ki-67 蛋白不僅影響惡性腫瘤癌細胞的增殖速度，同時能夠干預腫瘤上皮病灶組織的上皮間質轉化，促進癌細胞遠期器官的轉移。PTEN 的表達濃度的變化，能夠調控癌細胞的分化，促進癌細胞的分化成熟，調控癌細胞G1/S 周期比例，抑制腫瘤病情的進展[17，18]。mTOR 作為AKT 信號通路的下游效應蛋白，其表達濃度的上升能夠顯著提高AKT或者MAPK 等信號通路的激活，增加癌細胞的轉錄風險。PTEN 蛋白的異常表達能夠影響癌細胞凋亡速度，抑制癌細胞凋亡，提高癌細胞分增殖能力。Ki-67 蛋白上升能提高癌基因上游啟動子激活程度，促進癌基因的持續性擴增[19]。孫紅蘭等[20]探討了相關細胞因子的表達與中晚期結腸癌患者的病情關系，患者的病情越為嚴重、治療預后越差、病死率越高，mTOR 蛋白的表達陽性率越高。本研究發現，在結腸癌患者病灶組織中，mTOR、PTEN、Ki-67 蛋白表達波動較為明顯，結腸癌組mTOR 蛋白、Ki-67 蛋白陽性表達率高于對照組，結腸癌組PTEN 蛋白陽性表達率低于對照組（P＜0.05），表明mTOR 蛋白、Ki-67 蛋白、PTEN 蛋白在結腸癌組織及正常組織中的表達水平有明顯差異，這些指標均可能參與到了結腸癌的病情進展。mTOR、PTEN、Ki-67 蛋白的異常表達能夠導致癌細胞侵襲能力的改變、提高癌細胞對于淋巴結的粘附能力，影響結腸癌患者病情的進展。此外，不同TNM 分期、是否發生淋巴結轉移、不同腫瘤分化的結腸癌組織中mTOR 蛋白、PTEN 蛋白、Ki-67 蛋白陽性表達率分別比較，差異有統計學意義（P＜0.05），這可能與mTOR 蛋白的表達異常對于癌細胞浸潤能力的增強作用有關，同時還提高了淋巴結內皮粘附分子adherin 的表達。PTEN 蛋白的異常表達對于結腸癌患者臨床病理特征的影響，主要在于其對于癌細胞上皮間質轉換過程的影響，并調控了癌細胞周期等有關。但本次研究并未發現Ki-67 蛋白的表達與結腸癌患者臨床分期的關系，提示Ki-67 對于腫瘤的后期進展可能并無顯著的影響。

綜上所述，mTOR 蛋白與結腸癌患者的臨床分期、淋巴結轉移及癌細胞分化有關，PTEN 蛋白與結腸癌患者TNM 分期、腫瘤分化程度有關，Ki-67 蛋白表達與腫瘤分化程度、是否發生淋巴結轉移有關，可依此對腫瘤的篩查及預后判斷提供參考。