超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定血液和尿液中10種2C系列苯乙胺類衍生物

李錦昌，何洪源，張云峰，王瑞花*

（1．中國人民公安大學 偵查學院，北京 100038；2．公安部物證鑒定中心，北京 100038）

苯乙胺類衍生物是一類重要的精神活性物質，是在苯乙胺的結構基礎上設計出的具有致幻或致幻和興奮雙重作用的物質，根據結構特點可分為兩大類。其中一類是2C系列苯乙胺類衍生物（即二甲氧基苯乙胺衍生物），又稱2C系列化合物，最早在20世紀70年代由Alexander Shulgin合成，其苯乙胺苯環的2和5位有2個甲氧基取代，4位有1個取代基［1］。術語“2C”，表示所合成的致幻劑苯乙胺類衍生物的苯環和胺基之間的2個碳原子［2］。最早出現的2C系列衍生物為2C-B，之后出現了2C-C、2C-I和2C-T-2、2C-T-7等，2010年出現了稱為NBOMe的新型2C系列化合物［3］。2C系列化合物能產生與麥角二乙酰胺類似的強致幻效果，已有多種2C系列化合物被多個國家管制，在我國目前被管制的有13種［4］。

國外有關2C系列苯乙胺類衍生物的相關文獻較多，包括檢驗方法及體內外代謝研究，常用的前處理技術主要有液-液萃取（LLE）［5-6］和固相萃取（SPE）［7-8］，分析方法以氣相色譜-質譜法（GC-MS）［9-10］和液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）［11-13］為主。體外代謝以肝微粒體［14-16］和人肝細胞［17-18］進行研究，體內代謝多在小鼠和大鼠體內進行［15，19-20］，通過體內外的研究并結合實際案件檢材進行確證［21］。隨著2C系列化合物的更新換代，近年來報道的多為NBOMe化合物［12-13，22-23］。國內的相關研究很少，主要集中在體外樣品［24］，或單個2C類物質的檢測方法［25］。本文以我國管制的10種2C系列化合物為研究對象，建立了一種超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）方法，用于檢測血液和尿液中常見的10種2C系列化 合 物，包 括2C-H、2C-D、2C-P、2C-T-2、2C-T-4、2C-T-7、25D-NBOMe、25CNBOMe、25B-NBOMe和25I-NBOMe（結構式見圖1）。該方法簡便、快速，結果準確、可靠，靈敏度高，重復性好，能快速檢測血液和尿液中的2C系列化合物，滿足目前的案件檢驗需求。

圖1 10種2C系列化合物的化學結構Fig．1 Chemical structures of 10 2C-series phenethylamines

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯質譜儀（Acquity UPLC Xevo TQ MS，美國Waters公司），Masslynx工作站（美國Waters公司），Milli-Q純水系統（美國Millipore公司），BP210s電子天平（德國Sartorius公司），Thermo PRIMO R型高速離心機（上海創萌生物科技有限公司），Vortex Genie-2渦旋混合器（美國Scientific Industries公司），HGC-12型氮吹儀（美國PerkinElmer公司），Oasis?PRiME HLB固相萃取柱（150 mg/3 mL，美國Waters公司）。

10種2C系列化合物標準品（質量濃度：100 μg/mL，天津阿爾塔科技有限公司），甲醇、乙腈和甲酸銨（色譜純，國藥集團化學試劑北京有限公司）。實驗用水為去離子水，其余試劑均為分析純。空白血液、尿液來自健康的志愿者。

1.2 標準溶液配制

將10種2C系列化合物標準品分別置于棕色樣品瓶中。分別取10種標準品100 μL，用甲醇定容至1 mL，得到質量濃度為10 μg/mL的單標儲備液；將10種單標儲備液分別用甲醇稀釋并配制成1 μg/mL、100 ng/mL的混合標準儲備液，冷凍保存。實驗過程中根據需要用甲醇逐級稀釋。

1.3 樣品前處理

取0．5 mL空白血液或尿液于15 mL塑料離心管中，加入2 mL甲醇，渦旋混勻30 s，振蕩10 min，以8 000 r/min離心10 min后取1 mL上清液，過0．22 μm有機膜后，待分析。

1.4 實驗條件

1.4.1 色譜條件ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱（100 mm×2．1 mm，1．7 μm），流動相：A為甲醇，B為水（0．1%甲酸），流速：0．4 mL/min；柱溫：35℃；進樣量：2 μL。梯度洗脫程序：0~0．2 min，10%A；0．2~5．0 min，10%~90%A；5．0~6．1 min，90%A；6．1~6．5 min，90%~10%A。總運行時間為6．5 min。

1.4.2 質譜條件采用電噴霧電離正離子掃描模式（ESI+），多反應監測模式（MRM）檢測，毛細管電壓為1．5 kV，脫溶劑氣溫度為400℃，脫溶劑氣流速為900 L/h，錐孔氣流速為50 L/h。10種化合物的定性離子、定量離子、錐孔電壓、碰撞能量見表1。

表1 10種2C系列化合物的保留時間及質譜參數Table 1 Retention times and MS spectrum parameters for 10 2C-series phenethylamines

1.5 數據處理

圖譜的采集及定性分析采用MassLynx V4．1軟件，實驗數據采用Excel 2019和Origin 2021軟件進行處理。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

根據10種2C系列化合物的結構特點，選擇電噴霧正離子電離模式（ESI+）進行檢測。按照“1．2”方法分別配制100 ng/mL的10種化合物單標溶液，分別注入質譜儀中。開啟自動調諧功能，采用儀器自動優化得到10種2C系列化合物的錐孔電壓、碰撞電壓、駐留時間等參數，結果見表1。

2.2 色譜條件的優化

考察了ACQUITY UPLC?HSS T3（100 mm×2．1 mm，1．8 μm）、ACQUITY UPLC?BEH C18（100 mm×2．1 mm，1．7 μm）、ACQUITY UPLC?BEH HILIC（100 mm×2．1 mm，1．7 μm）3種色譜柱的分離效果。結果表明，ACQUITY UPLC?BEH C18柱和ACQUITY UPLC?HSS T3柱均能夠分離10種2C系列化合物，但C18柱對目標物的分離效果更好，響應值和靈敏度更高，因此選用ACQUITY UPLC?BEH C18柱。實驗考察了乙腈-水（0．1%甲酸）、甲醇-水（0．1%甲酸）、乙腈-水（0．1%甲酸，2 mmol/L甲酸銨）、甲醇-水（0．1%甲酸，2 mmol/L甲酸銨）分別為流動相時10種化合物的分離情況。結果顯示，以甲醇-水（0．1%甲酸）和甲醇-水（0．1%甲酸，2 mmol/L甲酸銨）作為流動相均可較好地改善大部分目標物的分離效果與色譜峰形，以后者作為流動相時各化合物的保留時間相對靠后。因此，實驗最終選擇ACQUITY UPLC?BEH C18柱，流動相為甲醇-水（0．1%甲酸）。在優化的色譜條件下，10種2C系列化合物的提取離子流圖（XIC）見圖2。

圖2 10種2C系列化合物的提取離子流圖（100 ng/mL）Fig．2 Extracted ion chromatograms of 10 2C-series phenethylamines（100 ng/mL）

2.3 前處理條件的優化

以回收率和基質效應為指標，比較了沉淀蛋白法（PPT）、液-液萃取法、固相萃取法對血液、尿液中質量濃度為100 ng/mL的10種2C系列化合物混合標準溶液的提取效果。

沉淀蛋白法：甲醇沉淀蛋白見“1．3”方法；乙腈沉淀蛋白法：取0．5 mL空白血液、尿液，加入2 mL乙腈于15 mL塑料離心管中，渦旋混勻30 s，振蕩10 min，以12 000 r/min離心10 min后取1 mL上清液，過0．22 μm有機濾膜后待分析。

液-液萃取法：取0．5 mL空白血液、尿液，加入2 mL乙酸乙酯于15 mL塑料離心管中，渦旋混勻30 s，振蕩10 min，以8 000 r/min離心10 min，將上清液轉移至10 mL尖底玻璃管中，空氣流下吹干，用0．5 mL甲醇定容，過0．22 μm有機濾膜后待分析。

固相萃取法：取0．5 mL空白血液、尿液，加入2 mL水稀釋，并置于15 mL塑料離心管中，渦旋混勻30 s，振蕩10 min，以8 000 r/min離心10 min。Oasis?PRiME HLB固相萃取柱依次經3 mL甲醇和3 mL水活化。取離心后的上清液過HLB柱，用1．5 mL 10%甲醇水溶液淋洗，1．5 mL乙腈-甲醇（9∶1，體積比）混合溶劑洗脫。收集洗脫液，空氣流下揮干，用0．5 mL甲醇定容，過0．22 μm有機濾膜后待分析。

不同前處理方法下的基質效應和回收率如圖3所示。結果顯示，LLE和SPE的回收率較低，基質效應嚴重。而沉淀蛋白法操作簡單快速，基質干擾小，且回收率高。本實驗還比較了甲醇和乙腈分別作為沉淀蛋白法的有機溶劑對于血液、尿液中2C系列化合物的萃取效果，發現甲醇沉淀蛋白法對目標物的回收率優于乙腈沉淀蛋白法。故選擇甲醇沉淀蛋白法進行前處理。

圖3 空白血液中10種2C系列化合物在不同前處理條件下的基質效應（A）和回收率（B）Fig．3 Matrix effects（A）and recoveries（B）of 10 2C-series phenethylamines in blank blood under different preparation conditions

2.4 方法學驗證

2.4.1 基質效應基質效應（ME）是指基質中干擾物會影響目標化合物的離子化效率，使目標化合物在分析儀器上的響應受到增強或抑制作用。實驗對目標分析物在不同基質中的基質效應進行評價，分別測定了低（1 ng/mL）、中（5 ng/mL）、高（20 ng/mL）濃度下混合標準溶液的色譜峰面積（S1），以及空白血液或空白尿液按“1．3”方法前處理后的上清液中分別添加低、中、高濃度混合標準溶液所得的色譜峰面積（S2），通過其比值（S2/S1）評估基質效應。結果表明，不同質量濃度的2C系列化合物質控樣本的基質效應為71．9%~112%，基質效應在可接受的范圍內，滿足檢測要求。

2.4.2 線性關系、檢出限與定量下限在空白血液、空白尿液中添加不同濃度的混合標準溶液，配制成質量濃度范圍為0．005~50 ng/mL的加標樣品，采用“1．3”方法進行前處理后上機檢測，并以定量離子對的峰面積（y）和目標分析物的添加濃度（x，ng/mL）繪制線性曲線。結果顯示，血液、尿液中10種2C系列化合物在0．005~50 ng/mL范圍內線性關系良好，相關系數（r2）為0．995 8~0．999 9。將空白樣品添加低濃度的混合標準溶液按照“1．3”方法進行樣品前處理后上機檢測，以定量離子對3倍信噪比（S/N）時的響應值對應的樣品質量濃度作為檢出限（LOD），以10倍S/N的響應值對應的樣品質量濃度作為定量下限（LOQ）。10種化合物在血液和尿液中的LOD分別為0．01~2 ng/mL和0．002~5 ng/mL，LOQ分別為0．02~5 ng/mL和0．005~10 ng/mL（見表2）。

表2 不同基質中10種2C系列化合物的線性方程、相關系數、檢出限和定量下限Table 2 Linear equations，correlation coefficients，LODs and LOQs for 10 2C-series phenethylamines in different matrixs

2.4.3準確度與精密度取空白血液和空白尿液，添加適量的混合標準溶液，配制成質量濃度分別為1、5、20 ng/mL的待測樣品，每個濃度水平配制3個平行樣。提取回收率通過測定空白血液或空白尿液在前處理之前添加對應濃度混合標準樣品的峰面積（S3）與其在前處理之后添加對應濃度混合標準樣品的峰面積（S4）的比值（S3/S4）進行計算。日內精密度由一天內不同時間下重復實驗6次進樣檢測，日間精密度由連續3天重復進樣檢測，以相對標準偏差（RSD）表示日內、日間精密度。結果顯示：在1、5、20 ng/mL加標水平下，血液中10種化合物的提取回收率為78．8%~94．7%，RSD為0．55%~15%；尿液中的提取回收率為79．8%~99．3%，RSD為0．44%~15%。表明本方法具有較高的準確度和精密度。尿液中10種2C系列化合物的回收率和RSD見表3。

表3 尿液中10種2C系列化合物的回收率和日內、日間精密度（n=3）Table 3 Recoveries，intra-day and inter-day precisions of 10 2C-series phenethylamines in urine（n=3）

2.5 方法應用

為驗證本方法的實用性，選取兩只雄性小鼠a、b，體重（200±20）g。在控制溫度（22±2）℃和濕度30%~70%的情況下，向小鼠a投喂含0．2 mg/kg 10種目標化合物的食物，小鼠b作為空白對照。2 h后，分別取兩只小鼠血液各0．5 mL、尿液各0．5 mL，按照本方法進行檢測。小鼠a的血液中檢出2C-H、2C-D、2C-P、2C-T-2、2C-T-4、2C-T-7、25D-NBOMe、25C-NBOMe、25BNBOMe、25I-NBOMe，質 量 濃 度 分 別 為5．7、3．2、0．4、5．9、3．3、9．9、14．3、10．4、13．9、12．3 ng/mL；尿液中檢出上述化合物的質量濃度分別為3．2、3．4、1．3、2．1、3．8、9．7、11．5、8．2、11．6、13．2 ng/mL；小鼠b的血液和尿液中未檢出10種目標化合物。結果表明，該方法可以滿足血液、尿液檢材中10種目標化合物的同時檢測要求。

3 結論

本研究針對法醫毒理學鑒定中常規的生物樣品血液和尿液，建立了基于超高效液相色譜-串聯質譜檢測生物樣品中10種2C系列化合物的分析方法。實驗通過對3種前處理方法的比較，確定采用甲醇沉淀蛋白作為前處理方法，通過對液相色譜與質譜檢測條件的優化，得到了較低的檢出限和定量下限。經方法學驗證，該方法操作簡便，取樣量少，靈敏度高，適用于血液、尿液中10種2C系列化合物的同時快速檢測。