QuEChERS結合超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜法同時測定全血中10種新型合成大麻素

張志遠，宋 輝*，李 想，許英健，朱 昱*，王 磊

（1．中國刑事警察學院 刑事科學技術學院，遼寧 沈陽 110854；2．新疆喀什市公安局，新疆 喀什 844000）

合成大麻素（Synthetic cannabinoids，SCs）是一類能夠與人體內源性大麻素受體CB1或CB2結合產生生理活性的人工合成化合物，其作用與天然大麻中的四氫大麻酚相似甚至更強，是目前品種最多、數量最大的新精神活性物質（New psychoactive substance，NPS）［1-2］。合成大麻素在世界各地快速蔓延態勢日趨嚴重，且新品種和新物質層出不窮、種類繁多。資料顯示［3］，截至2020年底，全世界范圍內已鑒定和報告給聯合國毒品和犯罪問題辦公室（UNODC）的新精神活性物質數量達1 047種，而合成大麻素類化合物數量已達794種，遠超芬太尼類（398種）［4］。吸食合成大麻素易產生心跳過速、血壓升高、胸痛、口齒不清、幻覺亢奮等副作用，出現自傷自殘等暴力行為［5-7］，甚至會導致心肌梗塞或器官衰竭造成死亡［8］。為堅決遏制和嚴厲打擊新型合成大麻素違法犯罪，我國自2021年7月1日起對合成大麻素類新精神活性物質實行整類列管［9］。

血液樣本是濫用藥物檢測最常用的生物檢材之一，色譜-質譜聯用技術是目前體內藥物毒物分析最重要的檢測手段。Ong等［10］建立了液相色譜-串聯質譜同時分析全血中29種合成大麻素的方法，目標物主要包括吲哚、吲唑酰胺和萘酰吲哚類合成大麻素，方法檢出限為0．1~6．0 ng/mL；王冠翔等［11］建立了超高效液相色譜-串聯質譜分析血液中吲唑酰胺類合成大麻素的方法，其中6種合成大麻素的檢出限為0．01~0．05 ng/mL；Krotulski等［12］采用液相色譜-質譜分析了血清中84種合成大麻素的凍融穩定性和長期穩定性，發現大多數合成大麻素的血清樣本在-20℃下可至少穩定1個月；徐恩宇等［13］分別建立了氣相色譜-質譜和液相色譜-串聯質譜快速鑒別血液中4種新型合成大麻素的方法，其中ABCHMINACA等4種新型合成大麻素采用液相色譜-串聯質譜法的檢出限為0．1~0．5 ng/mL，氣相色譜-質譜法需用時21 min，而液相色譜-串聯質譜法僅需5 min，表明液相色譜-質譜聯用技術更適合血液中合成大麻素的定性及定量檢測。

QuEChERS是一種針對復雜基質快速、簡單、廉價、有效、可靠和安全的前處理方法，比單一的乙腈沉淀蛋白、固相萃取等方法具有更好的提取與凈化效果［14-15］。基于四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜的平行反應監測（PRM）模式能夠以高精度和高分辨率監測目標物前體離子的所有碎片離子，同時具有可靠的定性分析和準確的定量分析功能，且具有較強的去除背景干擾能力，能夠顯著提高復雜背景下目標物的靈敏度［16］。本文建立了QuEChERS法結合超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜（UPLC-QE-Orbitrap MS）同時測定全血中10種新型合成大麻素的分析方法，其中ADB-BINACA（N-（1-氨基-3，3-二甲基-1-氧代丁-2-基）-1-芐基-1H-吲唑-3-甲酰胺）、ADB-BICA（N-（1-氨基-3，3-二甲基-1-氧代丁-2-基）-1-芐基-1H-吲哚-3-甲酰胺）、AB-FUBICA（N-（1-氨基-3-甲基-1-氧代丁-2-基）-1-（4-氟芐基）-1H-吲哚-3-甲酰胺）等物質尚未見相關報道。

1 實驗部分

1.1 儀器與設備

UltiMate 3000高效液相色譜儀、Thermo Scientific Q Exactive四極桿/軌道阱高分辨質譜儀、Xcalibur質譜 工作站、Hypersil GOLDTMVanquish色 譜 柱（100 mm×2．1 mm，1．9 μm）均購 于 美國Thermo Scientific公司；梅特勒電子天平（精確值：十萬分之一，瑞士Mettler公司）；HC-3018高速離心機（安徽中科中佳公司）；XW-80A渦旋振蕩器（海門市麒麟醫用儀器廠）。

1.2 材料與試劑

AB-FUBICA、5F-ADBICA（N-（1-氨甲酰基-2，2-二甲基丙基）-1-（5-氟戊基）吲哚-3-甲酰胺）、ADB-BICA、ADB-FUBICA（N-（1-氨基-3，3-二甲基-1-氧代丁-2-基）-1-（4-氟芐基）-1H-吲哚-3-甲酰胺）、ADB-BINACA、ADB-BUTINACA（N-（1-氨基-3，3-二甲基-1-氧代丁-2-基）-1-丁基-1H-吲唑-3-甲酰胺）、4F-MDMB-BUTINACA（2-［1-（4-氟丁基）-1H-吲唑-3-甲酰氨基］-3，3-二甲基丁酸甲酯）、AMB-FUBINACA（3-甲基-2-［1-（4-氟芐基）吲唑-3-甲酰氨基］丁酸甲酯）、5F-ADB（3，3-二甲基-2-［1-（5-氟戊基）吲唑-3-甲酰氨基］丁酸甲酯）、MDMB-4en-PINACA（3，3-二甲基-2-［1-（4-戊烯-1-基）-1H-吲唑-3-甲酰氨基］丁酸甲酯）共10種合成大麻素對照品固體粉末（純度＞98%，美國GlpBio公司）。甲酸、甲醇、乙腈（色譜純，美國Fisher Scientific公司），無水MgSO4、無水Na2SO4（分析純，沈陽國藥集團）。空白血（沈陽第四人民醫院提供）；雄性SD大鼠（中國醫科大學動物實驗中心提供）；案例血液樣本來自公安機關在涉毒案件中取樣。

1.3 混合標準溶液的配制

精確稱量各對照品固體粉末5 mg，置于10 mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容，渦旋混勻10 s，配制成0．5 mg/mL的混合標準儲備溶液。準確量取混合標準儲備溶液適量，以甲醇逐級稀釋，渦旋混勻，制備質量濃度分別為500．0、100．0、50．0、20．0、10．0、5．0、2．0、1．0、0．5、0．2、0．1 ng/mL的系列混合標準溶液備用，-20℃冷凍保存，臨用時放至常溫。

1.4 樣本QuEChERS法處理

準確量取全血樣本0．5 mL置于15 mL離心試管中，加入1．5 mL乙腈和350 mg無水MgSO4，渦旋振蕩5 min，以10 000 r/min離心3 min，取上清液過0．22 μm有機微孔濾膜，裝瓶后供分析。

1.5 動物實驗

取雄性SD大鼠2只，單只重約230 g，采用腹腔注射5F-ADBICA與MDMB-4en-PINACA混合藥物方式，給藥劑量均為5 μg/kg，給藥1 h后分別內眥取血各0．5 mL，按照“1．4”方法處理，待檢測。

1.6 色譜-質譜條件

1.6.1 色譜條件Hypersil GOLDTMVanquish色譜柱（100 mm×2．1 mm，1．9 μm）；流動相：0．1%甲酸水（A）和0．1%甲酸乙腈（B），流速為0．30 mL/min，柱溫為40℃，進樣量為10 μL。梯度洗脫程序：0~9 min，5%B；9~11 min，5%~100%B。

1.6.2 質譜條件離子源：采用加熱電噴霧離子源正離子模式（HESI+），離子源溫度：400℃；離子傳輸管溫度：350℃；噴霧電壓：3 500 V；輔助氣：3 000 mL/min，鞘氣：12 000 mL/min；掃描模式：采用全掃描（Full MS）/平行反應監測（PRM）模式，Full MS分辨率（R）：70 000，質量掃描范圍：m/z150~600；PRM分辨率：17 500，Orbitrap最大容量：2×105，最大注入時間：100 ms；階梯碰撞能量：20、40、60 eV。

2 結果與討論

2.1 實驗條件的優化

2.1.1 色譜條件的選擇采用10．0 ng/mL混合標準溶液進樣，比較了甲醇-水、0．1%甲酸水-乙腈、0．1%甲酸水-0．1%甲酸乙腈3種不同流動相對各組分分離效果及色譜峰形的影響。實驗表明，0．1%甲酸水-0．1%甲酸乙腈比其他兩種流動相的洗脫分離效果更好，10種目標物出峰相對較快，色譜峰形較好。因目標物結構中均含有電負性基團，流動相中加入適量甲酸有利于形成［M+H］+分子離子峰，使得離子響應強度增加［15］。本實驗設置流動相流速為0．30 mL/min，在保留時間（Rt）5．0~9．0 min范圍內，10種合成大麻素離子峰的分離效果相對較好，其PRM色譜圖如圖1所示。

圖1 10種合成大麻素的PRM色譜圖（10．0 ng/mL）Fig．1 PRM chromatogram of 10 synthetic cannabinoids（10．0 ng/mL）the peak numbers of 1-10 denoted were the same as those in Table 1

2.1.2 質譜條件的選擇按照“1．6”方法，取10．0 ng/mL混合標準溶液進樣，分別在300、350、400、450、500℃下進行平行測定（n=6），考察離子源溫度對10種合成大麻素峰面積響應值的影響。結果表明，隨著溫度的升高，各目標物的響應值均明顯增強，并在400℃時達到峰值，離子源溫度繼續升高至500℃時，響應值無顯著增加。綜合考慮儀器保護及過高溫度對目標物穩定性的影響，選擇離子源溫度為400℃。設置階梯碰撞能量（Stepped CE）：20、40、60 eV，對目標物的準分子離子進行碎裂，可獲得不同能量碎裂離子的加合圖譜，碎片離子信息更為豐富。10種合成大麻素的質譜信息見表1。

表1 10種合成大麻素的保留時間（Rt）、分子式及質譜信息Table 1 Retention times，formulas and mass spectrometry parameters of 10 synthetic cannabinoids

2.1.3 QuEChERS法的優化參考已有方法［17］，本文QuEChERS法采用乙腈進行提取，以硫酸鹽作為脫水劑和鹽析劑，不僅可以脫掉全血中的水分，且能夠增強水相的離子強度，從而增大全血中合成大麻素的分配系數，提高回收率。選擇無水Na2SO4、無水MgSO4兩種無機鹽，以回收率為考察目標對相同濃度（10．0 ng/mL）的全血添加樣本進行比較實驗。結果顯示，等量使用時無水MgSO4的回收率相對較高，且脫水過程中無結塊現象。進一步考察了無水MgSO4用量（200、250、300、350、400、500 mg）對10種合成大麻素回收率的影響，結果顯示，當用量超過350 mg后，目標物的回收率不再升高，因此確定無水MgSO4的用量為350 mg。

2.2 質譜碎裂分析

2.2.1 目標化合物分類按照化合物的母核結構，本文檢測的10種合成大麻素可分為兩大類：吲哚酰胺類，如AB-FUBICA、5F-ADBICA、ADB-FUBICA和ADB-BICA等；吲唑酰胺類，如ADBBINACA、ADB-BUTINACA、4F-MDMB-BUTINACA、AMB-FUBINACA、5F-ADB和MDMB-4en-PINACA等。其中吲唑酰胺類合成大麻素是傳統JWH吲哚系列的升級替代產品［18］，具有比吲哚類合成大麻素更強的精神活性［2］。

2.2.2 碎裂方式分析在HESI+/PRM模式下，10種目標物的二級質譜碎片離子碎裂方式呈以下特點：①分子結構中鏈接部酰胺的C—N鍵均可發生α斷裂，形成帶側鏈的吲哚/吲唑酰陽離子；②相似結構化合物的碎裂方式相近，特征碎片離子一致；③母核（吲哚/吲唑核）碎片或母核N原子取代基的碎片離子峰特異性明顯；④準分子離子峰［M+H］+的豐度值普遍較低。

AB-FUBICA、5F-ADBICA、ADB-FUBICA、ADB-BICA、ADB-BINACA和ADB-BUTINACA 6種化合物的結構相近，均為氨甲酰基吲哚/吲唑酰胺類合成大麻素，即頂部區域均含有氨甲酰基團，主要區別為前4種物質的母核為吲哚環結構，后2種物質的母核為吲唑環結構，母核中N原子的尾端取代基分別為氟芐基、5F-戊基、芐基和丁基等。6種化合物相近的碎裂方式為：分子結構中酰胺C—N鍵均發生α斷裂，形成帶側鏈的吲哚/吲唑酰陽離子；當母核N原子上的取代基為芐基或氟芐基時，斷裂產生豐度值最高的芐基或氟芐基陽離子；當母核N原子上的取代基為5F-戊基、丁基時，則發生雜環與烷烴N—C鍵斷裂并伴隨γH重排，形成吲哚/吲唑核酰陽離子m/z144或m/z145特征碎片，該碎片是區分吲哚與吲唑類合成大麻素的標志性碎片；6種化合物頂部區域均易發生酰胺C—N鍵斷裂，產生準分子離子［M+H］+-NH3碎片離子，或氨甲酰基整體脫裂，產生準分子離子［M+H］+-CONH3碎片離子。具有代表性的3種物質的二級質譜碎裂方式分析如圖2A~C所示。

4F-MDMB-BUTINACA、AMB-FUBINACA、5F-ADB和MDMB-4en-PINACA 4種化合物的結構相近，頂部區域酰胺鍵N原子上的鏈接組均為丁酸甲酯基團，母核均為吲唑環結構。主要區別在于母核N原子上的尾端取代基分別為4-氟丁基、氟芐基、5-氟丁基和1-戊-4-烯基，該類物質的主要碎裂方式與上述吲哚酰胺類物質相似。且4種物質的頂部區域均可發生酯基脫裂，形成準分子離子［M+H］+-COOCH3碎片離子。代表性物質的二級質譜碎裂方式分析如圖2D所示。

圖2 4種代表性合成大麻素的MS2質譜圖及碎裂方式分析Fig．2 MS2 spectra and fragmentation analysis of 4 typical synthetic cannabinoids

2.3 方法學建立

2.3.1 工作曲線、檢出限及定量下限采用空白血液添加混合標準溶液方式，制備混標質量濃度分別為0．05、0．1、0．2、0．5、1．0、2．0、5．0、10．0、20．0、50．0、100．0 ng/mL的系列全血加標樣本，按照“1．4”前處理方法和“1．6”儀器條件，由低到高濃度依次測定。以各目標物的質量濃度為橫坐標（x，ng/mL），對應的定量離子響應值為縱坐標（y）進行線性回歸。結果顯示，10種合成大麻素在0．05~100．0 ng/mL或0．20~100．0 ng/mL范圍內呈良好線性關系，相關系數（r2）均不小于0．999 0，檢出限（LOD，S/N≥3）為0．01~0．05 ng/mL，定量下限（LOQ，S/N≥10）為0．05~0．20 ng/mL（見表2）。

表2 10種合成大麻素的線性關系、檢出限及定量下限Table 2 Linear relations，LODs and LOQs of 10 synthetic cannabinoids

2.3.2 加標回收率、基質效應及相對標準偏差采用空白基質添加混合標準溶液方式，分別制備10種合成大麻素質量濃度為0．2、5．0、50．0 ng/mL的空白血液加標樣本，每個濃度平行制備3份。按照“1．4”前處理方法和“1．6”儀器條件進行測定，以加標樣本中各目標物定量離子的峰面積為A；空白血液經QuEChERS法提取后加標樣本中定量離子的峰面積為B；對應濃度混標溶液中各目標物定量離子的峰面積為C。參照Matuszewski［19］方法進行計算：加標回收率=A/C×100%，基質效應=B/C×100%。同一濃度全血加標樣本當日重復測定6次，計算日內相對標準偏差（RSD），連續測定3 d，計算日間RSD。結果顯示，10種目標物在3個加標水平下的回收率為92．1%~115%，基質效應為86．6%~115%；日內RSD均不大于8．5%，日間RSD均不大于10%（見表3）。

表3 10種合成大麻素的回收率、基質效應及相對標準偏差（n=6）Table 3 Recoveries，matrix effects and RSDs of 10 synthetic cannabinoids（n=6）

2.4 動物實驗結果

應用本方法對注射混合藥物的SD大鼠血液進行檢測，結果顯示，給藥1 h后SD大鼠血液中均檢出5F-ADBICA和MDMB-4en-PINACA，2只大鼠血液中5F-ADBICA的平均質量濃度為2．13 ng/mL，MDMB-4en-PINACA為1．76 ng/mL。表明所建方法適用于實際樣品中合成大麻素物質的檢驗。

2.5 案例應用

應用本方法對一起因吸食合成大麻素導致傷害致死案件的嫌疑人血液樣本進行檢測，經與標準物質的色譜峰保留時間及質譜特征比較，確認該樣本中檢出MDMB-4en-PINACA。平行2個樣本，每個樣本測定6次，并結合工作曲線計算得到MDMB-4en-PINACA的平均質量濃度為3．72 ng/mL，測量值的RSD（n=6）均不大于5．4%。本方法穩定、檢測結果可靠，檢測結果為吸食合成大麻素行為認定提供了科學依據。

3 結論

本文通過對QuEChERS前處理方法、色譜流動相和質譜條件進行優化，建立了全血中10種新型合成大麻素的超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜檢測方法，對10種目標物的質譜信息、碎片離子主要碎裂方式進行分析，并進行了方法學考察。本方法具有操作簡便快捷、數據穩定、檢測靈敏度及回收率高的特點，動物實驗和真實案例的血液樣本檢測結果證明方法可靠，能夠滿足濫用合成大麻素案件檢驗鑒定的實際需要。