谷子莖尖誘導愈傷的品種篩選及分化條件探究

祁東梅，史慎奎，王玉芳，王春芳

(河北民族師范學院生物與食品科學學院,河北 承德 067000)

谷子(Setaria italica(L.)P.Beauv.)屬禾本科植物,一年生草本,原產于中國,在我國北方地區廣泛種植,具有抗旱、耐瘠、抗逆性強、適應性廣等特點,是干旱半干旱地區的重要糧食作物之一,具有較好的種植前景[1]。但是谷子作為小作物其研究力量相對薄弱,優質品種的培育和種業發展方面的新技術研發和平臺構建缺乏[2]。隨著世界人口的增長,對糧食的需求量也越來越大,作物的改良顯得尤為重要,而建立一套高效穩定的谷子組織培養再生體系,是谷子遺傳轉化和改良的重要前提。廣義的植物組織培養是在無菌條件下將部分組織接種到培養基中,在合適的條件下將組織再生為完整植株的過程[3]。在該過程中,愈傷的培養是組織培養順利進行的基礎,愈傷的再生體系建立是現代生物技術在谷子上展開應用的前提和關鍵,影響優質高效品種培育、抗逆性品種的選育和種業發展。此外,提高谷子的遺傳轉化效率,構建谷子現代育種技術體系,提升作物育種水平,也是目前谷子產業發展的重要任務[2]。

谷子的組織培養方面已經開展了大量工作。許智宏等較早研究谷子的組織培養,利用谷子幼穗作為外植體獲得了再生植株[4]；趙連元、董云洲和刁現民等在谷子原生質體和體細胞無性系的組織培養中均獲得成功[5-7]。近年來,許多學者利用胚、幼穗、側芽等外植體均成功培養出了愈傷組織及再生植株[8,9],包括陳倩楠等利用谷子幼穗進行胚性愈傷組織的誘導[10],李顏方等利用成熟胚對谷子的再生和轉化體系進行優化[11],賀榆婷等利用成熟胚篩選出高效再生的谷子基因型[12],尹藝臻等利用種子建立愈傷組織的再生體系[13]等。目前在谷子的組織培養中,選用的材料以胚胎和花藥居多[14],但花藥取材受季節和種植時間的限制,而利用莖尖作為外植體的研究較少。莖尖由種子萌發獲得,研究材料不受季節、環境和生長階段的限制,更加方便易得。王寒玉等[15]和楊瀾等[16]都利用莖尖對轉化體系進行探究,但兩者對分化體系中激素使用條件的探究較少。

本研究利用試驗田中種植的31 個品種,從中篩選出農藝性狀較優良且更適宜在承德本地播種的品種作為實驗材料,取其莖尖為外植體進行組織培養,篩選出芽率高、愈傷組織誘導率高、染菌率低的谷子品種。后續選定師院-1 作為實驗材料,探究不同激素對谷子愈傷組織誘導和分化的影響,優化莖尖再生體系的條件,為谷子莖尖組織培養和遺傳轉化研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本研究中所用的谷子品種共31 個,由河北民族師范學院雜糧產業協同創新中心提供,品種名稱見表1。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子消毒及外植體的獲得

種子消毒過程在超凈工作臺中進行。取適量的種子于小燒杯中,75%乙醇洗3～5 次,再用0.1%升汞浸泡5 min,消毒過程中不斷搖晃使其更徹底,然后用無菌水清洗5～10 次,洗去殘留升汞。用滅菌的鑷子將消毒后的種子接種在培養基上。每個培養皿接種50～70 粒種子,25 ℃光照恒溫培養箱中暗培養2～3 d,待莖尖長到1.5 cm 左右將其切下接種到愈傷誘導培養基上。

1.2.2 愈傷的誘導和分化

將長好的莖尖用鑷子和小刀在濾紙上切下后放入50 mL 小燒杯中,75%的乙醇浸泡兩次,每次30 s,再用2%的次氯酸鈉浸泡15 min,最后用無菌水清洗3 次后接種于含不同激素的愈傷組織誘導培養基中。培養基主要成分如下:

①在培養基MS＋10 g/L 瓊脂＋30 g/L 蔗糖中,添加不同濃度的2,4-D(0.4、0.8、1.0、1.2 mg/L),探究不同濃度的2,4-D 對愈傷組織誘導的影響。

②在培養基MS＋10 g/L 瓊脂＋30 g/L 蔗糖＋1.0 mg/L 2,4-D 中,添加不同濃度的KT(0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/L),探究不同濃度的KT 對愈傷組織誘導的影響。

③在培養基MS＋10 g/L 瓊脂＋30 g/L 蔗糖＋1.0 mg/L 2,4-D 中,添加不同濃度的ZT(0.8、1.0、1.2 mg/L),探究不同濃度的ZT 對愈傷組織誘導的影響。

將誘導出的胚性愈傷組織(顏色淡黃,硬顆粒狀,質地緊密)在無菌條件下分別接種到不同種激素及不同濃度的分化培養基上,各培養基主要成分如下:

④在培養基MS＋10 g/L 瓊脂＋30 g/L 蔗糖＋1.0 mg/L 2,4-D 中添加不同濃度的TDZ(0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L)的分化培養基上,觀察統計愈傷分化效果。

⑤在培養基MS＋10 g/L 瓊脂＋30 g/L 蔗糖＋2.0 mg/L 6-BA 中添加不同濃度的NAA(0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L)的分化培養基上,觀察統計愈傷分化效果。

1.3 數據分析

發芽率(%)＝發芽的種子數目/接種的種子總數×100

愈傷組織誘導率(%)＝形成的愈傷數/接種的莖尖總數×100

愈傷組織染菌率(%)＝染菌愈傷數/接種的莖尖總數×100

愈傷分化率(%)＝分化出苗數/接種的愈傷總數×100

2 結果分析

2.1 不同品種谷子的發芽率、愈傷組織誘導率和染菌率比較

為篩選出發芽率較高的品種,本研究首先將31個品種谷子的種子無菌消毒后接種到MS 培養基上,培養2～3 d,待莖尖長至1 cm 左右,統計種子的發芽率。通過萌發實驗,發現發芽率超過50%的有19 個品種(表1),其中魯2115、魯2181、魯7034、大悲無名谷、龍山紅谷、朝鮮小黃谷、9115、8 月-62、黑粘谷、紅粒谷、2 月-20、師院-1、跑死馬、4 月64 這14 個品種的發芽率均在70%以上。

表1 31 個谷子品種的發芽率、愈傷組織誘導率、染菌率Table 1 Statistics of germination rate，callus induction rate and bacterial infection rate of 31 varieties of millet

然后,將不同品種的谷子莖尖接種在MS 誘導培養基中,其中2,4-D 濃度為0.6 mg/L,培養25 d,觀察愈傷組織的狀態并統計愈傷誘導率。結果顯示,31 個谷子品種中,紅粘谷、魯2181、魯7111、大悲無名谷、濟優5 號、朝鮮小黃谷、9115、師院-1、跑死馬、長農35、4 月64 這11 個品種的愈傷組織誘導率較高,均超過50%,其中紅粘谷的愈傷組織誘導率最高,可達81%；師院-1 愈傷組織誘導率為65%。而豫谷18 和小挫根的愈傷組織誘導率較低,不足20%,其余品種的愈傷組織誘導率處于20%～50%范圍內。

在愈傷誘導的同時還統計了各品種的染菌率,31 個品種中有12 個品種的染菌率較高,染菌率在5%以上,其中魯2115 的愈傷組織染菌率最高,可達21.5%；有11 個品種的染菌率較低,在0～2%之間,豫谷1 的染菌率最低,為0；還有8 個品種的染菌率在2%～5%之間。

通過對比分析,不同品種的谷子在進行組織培養過程中,其種子的發芽率、愈傷組織誘導率和染菌率差別較大。綜合比較,紅粘谷、9115、長農35、4 月64、師院-1 這5 個品種相對優勢較大,符合實驗篩選條件。在后續實驗中選擇師院-1 進行外植體系的構建。

2.2 谷子愈傷組織誘導條件的探究

2.2.1 不同濃度2，4-D 對愈傷誘導的影響

常用的植物激素包括生長素和細胞分裂素,其中生長素有2,4-D、NAA、IAA 等,細胞分裂素有TDZ、6-BA、KT 等。為探究誘導愈傷最適的2,4-D濃度,將師院-1 的種子萌發后取莖尖組織接種到誘導愈傷的①號培養基中(圖1,a-b),其中2,4-D 的濃度分別設置為0.4、0.8、1.0、1.2 mg/L。觀察結果顯示,含有2,4-D 的培養基上培養3 d 初級愈傷形成(圖1,d-g),經過繼代形成質地較致密塊狀胚性愈傷組織(圖1,h),當2,4-D 的濃度為1.0 mg/L時,愈傷率最高為87.5%(表2)。

圖1 不同濃度2，4-D 下師院-1 莖尖愈傷組織的誘導表達Fig.1 Induction and expression of stem-tip callus of Shiyuan-1 at different concentrations of 2，4-D

表2 不同2，4-D 濃度下培養兩周的愈傷誘導率Table 2 The induction rate of callus under different 2，4-D concentration for two weeks

2.2.2 不同濃度KT＋2，4-D 對愈傷誘導的影響

在確定該體系中2,4-D 的最適濃度為1.0 mg/L后,探究誘導愈傷過程中最適的KT 濃度。采用含有1.0 mg/L 2,4-D 的②號培養基,KT 濃度分別設置為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/L。莖尖轉移到培養基后25 ℃暗培養。一周后觀察顯示,KT 濃度較高時莖尖愈傷誘導率極低,分化率很高。KT 濃度較低時莖尖可誘導形成愈傷(圖2)。誘導22 d 的結果顯示,當KT 為0.1 mg/L 時,愈傷誘導率為50%(表3),但相對于只使用2,4-D 時愈傷誘導率降低。

表3 不同濃度的KT 培養基中愈傷誘導率Table 3 The induction rate of callus under different KT concentration

圖2 不同濃度的KT 培養基上誘導的愈傷狀態Fig.2 Callus induction under different concentration of KT medium

2.2.3 不同濃度ZT＋2，4-D 對愈傷誘導的影響

為探究誘導愈傷過程中最適的ZT 濃度,采用含有1.0 mg/L 2,4-D 的③號培養基,其中ZT 濃度分別設置為0.8、1.0、1.2 mg/L。莖尖在該培養基中25 ℃暗培養,28 d 后觀察各ZT 濃度培養基對莖尖的誘導效果。經對比分析,ZT 濃度為0.8、1.0、1.2 mg/L 時均有白色略透明的愈傷組織形成,誘導效果明顯(圖3)。同時,也發現添加ZT 后誘導的莖尖愈傷褐化現象明顯增多。根據數據統計,ZT 濃度為1.0 mg/L時,愈傷誘導率最高,誘導效果最好,0.8 mg/L 時次之,1.2 mg/L 時最弱(表4)。因此,對師院-1 莖尖的誘導效果最佳的ZT 濃度為1.0 mg/L。

表4 各濃度ZT 培養基中愈傷誘導率Table 4 The induction rate of callus under different KT concentration

圖3 不同濃度ZT 對師院-1 莖尖愈傷組織的誘導Fig.3 The callus induction of foxtail millet Shiyuan-1 under different ZT concentration

2.3 谷子愈傷組織再分化條件探究

2.3.1 不同濃度TDZ＋2，4-D 對愈傷誘導芽的影響

設計生長素和細胞分裂素的比例進行愈傷組織的分化條件探究。將愈傷組織接種于不同濃度的2,4-D＋TDZ 培養基上,2,4-D 濃度固定為1.0 mg/L,TDZ 濃度設置為0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L 時,觀察統計愈傷分化情況(圖4)。結果顯示,當TDZ 濃度為1.0 mg/L 時愈傷分化生苗率最高為35%(表5),其轉綠、出芽和生根現象明顯。同時也發現部分已分化愈傷轉綠后綠點消失,逐漸褐化死亡,死亡后愈傷周圍出現顆粒狀、松散、較干燥的細胞團,其中殘留的綠點一段時間后仍無法分化出叢生苗(圖4)。

圖4 2，4-D 與不同濃度TDZ 組合的愈傷組織出芽Fig.4 2，4-D callus budding in combination under different concentrations of TDZ

表5 2，4-D 與不同濃度TDZ 組合的愈傷組織分化情況Table 5 Callus differentiation of different concentrations of TDZ in combination with 2，4-D

2.3.2 不同濃度NAA＋6-BA 對愈傷誘導芽的影響

將愈傷組織接種于不同濃度的NAA＋6-BA 培養基上進行愈傷分化條件探究。將6-BA 的濃度設置為2.0 mg/L,NAA 濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L,觀察愈傷分化情況。結果顯示,添加6-BA為2.0 mg/L,NAA 為0.6 mg/L 時,愈傷轉綠、出芽和生根現象明顯(圖5),分化率最高為28%(表6),并且愈傷組織褐化較輕,質地緊密,生長狀況良好。由愈傷組織分化得到的再生植株,經過煉苗后,移栽入試驗田。

表6 6-BA＋不同濃度NAA 的愈傷組織分化率Table 6 Differentiation rate of callus under different concentrations of 6-BA＋NAA

圖5 不同濃度6-BA＋NAA 的愈傷誘導芽分化Fig.5 Bud differentiation of callus induced by 6-BA＋NAA at different concentrations

3 討論

目前關于谷子組織培養中愈傷誘導及再生體系的建立均有報道,但其轉化效率遠低于水稻和擬南芥[17]。基因型在一定程度上決定了愈傷的誘導率和愈傷狀態[11,18-19],因此篩選合適的基因型建立谷子組織培養體系仍是重點。本研究選取了適宜在承德地區種植的31 個不同基因型谷子,取莖尖進行愈傷誘導,篩選出5 種萌發率和愈傷誘導率較高、染菌率低的品種,其中部分谷子品種萌發率較低,甚至低于50%,這可能是由于當年的種子成熟度不夠或者是成熟之后沒有及時收獲,增加了雨水浸泡概率,使種子活力受到影響所致。

在報道的愈傷誘導研究中,王寒玉等[15]以長生06、晉谷21 和長農35 作為供試材料,2,4-D 的濃度設置范圍在0.5～2 mg/L,探究谷子莖尖愈傷組織的誘導條件,發現不同品種對2,4-D 的濃度需求不同,隨2,4-D 濃度變化,愈傷誘導率變化也不同。本研究在31 個品種的出愈率篩選中將2,4-D 濃度確定為0.6 mg/L,不同基因型的莖尖愈傷誘導率不同,這與王寒玉等[15]結果相似。而在后續探究最適2,4-D 濃度時,其濃度范圍又設置為0.4～1.2 mg/L,因此,對于其他濃度下另外30 個品種的出愈率是否會變化還有待驗證。在愈傷誘導過程中,除了2,4-D的加入,還可引入細胞分裂素KT、ZT 或TDZ,也可能會增加愈傷的誘導率[15]。本文結果顯示,在添加KT 或ZT 后師院-1 的愈傷誘導率并沒有增加。這其中除了基因型起主導作用外,還可能與培養基組分不同有關,但是對其他谷子品種莖尖的出愈率影響還有待驗證。

對于分化體系中激素的配比,文獻報道的有NAA 和KT 組合[12],IAA 和KT 組合[20],TDZ[15]等。本研究探究其他激素的組合對愈傷分化的影響,結果顯示在添加2 mg/L 6-BA 的前提下,添加0.6 mg/L NAA 時愈傷分化率最大。在2,4-D 濃度設置為1 mg/L,TDZ 濃度為1.0 mg/L 時愈傷分化生苗率最高。而激素的組合和濃度的配比在品種間的差異性還有待研究。此外,在水稻、玉米等作物中研究表明,多效唑可提高愈傷組織的分化率[21-22],是否對谷子愈傷分化有促進作用需進一步驗證。研究過程中還發現,谷子的愈傷誘導和分化過程中存在水質化、褐化現象,而對于褐化的抑制也有研究報道[23-26],今后可參考進行改進。

4 結論

本實驗選取31 個品種進行萌發率、愈傷誘導率、染菌率的統計,不同品種之間存在一定的差異,綜合3 方面結果,選出紅粘谷、9115、長農35、4 月64、師院-1 這5 個品種。以師院-1 的莖尖進行愈傷組織誘導,當2,4-D 濃度為1 mg/L 時誘導率最高。在2,4-D 存在的條件下添加KT 或ZT,愈傷誘導率最高時對應的KT 濃度為0.1 mg/L,ZT 為1.0 mg/L。在愈傷分化條件的探究中,激素濃度組合分別為1.0 mg/L 2,4-D＋1.0 mg/L TDZ 或2.0 mg/L 6-BA＋0.6 mg/L NAA 時,分化率較高。本研究結果為谷子的轉基因體系建立奠定了一定的理論基礎。